Structuur van HIV-1 capside Assemblies van cryo-elektronenmicroscopie en iteratief Helical Real-ruimte Wederopbouw

1. Frozen-gehydrateerd EM prepareren Omdat HIV-1 capside-eiwit (CA) samenstellingen 9 stabiel zijn alleen in hoge zout (1 M NaCl) buffer, die een sterke achtergrond geluid in cryo-EM beelden draagt, gebruiken we een snelle verdunning en back-side blotting methode om tijdelijk minder zout concentratie bij de voorbereiding van de bevroren gehydrateerd EM grid. Glimontlading de koolstof kant van de 200-mesh R2 / 1 Quantifoil koperen roosters onder 25mA voor 25 seconden. Gebruik een vernevelaar om de vochtigheid in de milieu-kamer, een zelfgemaakte handleiding zwaartekracht zuiger, te brengen tot 80%. In de FEI Vitrobot Plunger Dewar, koele vloeistof ethaan met behulp van vloeibare stikstof. Monteer de duik-bevriezing Dewar op de handleiding zwaartekracht zuiger. Van toepassing zijn 2,5 ul van voorgemonteerde CA oplossing op de koolstof-kant van het net, die is gemonteerd op een tang, en laad de tang op de zuiger met de koolstof-kant van het net van u af. Voeg 3 pi van een laag zout verdunning buffer (100 mM NaCl) aan de achterkant van de grid en onmiddellijk blot de achterkant van de grid met een stuk filtreerpapier. De hele achterkant van de grid moet in nauw contact met de filter papier voor ongeveer 6 seconden, voordat u de filter papier. Onmiddellijk duiken het rooster in vloeibare ethaan na het verwijderen van het filter papier. Verwijder de tang uit de zuiger en snel het net te zetten in een raster opbergdoos. 2. Cryo-elektronenmicroscopie van CA buisvormige assemblages Laad de bevroren gehydrateerd rooster in een FEI Polara G2 elektronenmicroscoop werken op 200kv en voorzien van een Gatan 4Kx4K CCD camera. Onder een lage dosis-search-modus, bij een vergroting van ~ 200x en met een dosis <0.001e – / A 2, het scherm van de hele grid voor gebieden met geschikte ijs en red de posities van deze gebieden in een fase-bestand. Roep de opgeslagen posities en verder het scherm van deze gebieden op een vergroting van 3900 x in lage dosis-search mode. Kies de gebieden met een gelijkmatige, dunne laag van ijs met goed gescheiden, lange buizen meer dan gaten, voor het verzamelen van gegevens. Sla de locaties van deze gebieden in een tweede fase-bestand. Schakel over naar belichtingsstand bij een vergroting van 59.000 x, inzet een 100 um objectieve diafragma, en stel het doel stigmatism en bundelintensiteit voor een dosis van ~ 15 e – / A 2 per blootstelling. Keer terug naar de lage-dosis-modus voor het zoeken, ga dan naar een opgeslagen positie en identificeren en in het midden een goede buis met de CCD camera. Schakelaar om de scherpstelling modus, om de focus, en stel een defocus waarde, normaal gesproken tussen 0,5 en 2,5 um. Schakel over naar de belichting, stelt een belichtingstijd 0,3-0,5 seconde, voor een dosis van 15 e – / A 2, en het verzamelen van een beeld. De beelden worden verzameld op een bord camera, en de films zou moeten worden toegestaan ​​om zich te vestigen voor het 10 seconden voordat een opname wordt gemaakt. Ga naar de volgende opgeslagen positie en herhaal stap 5 om meer afbeeldingen te verzamelen. De films zijn ontwikkeld in volle kracht D19 gedurende 12 minuten en gedigitaliseerd met behulp van een Nikon Super Coolscan 9000 ED scanner op een pixelgrootte van 6,35 micrometer. Het formaat van beeldbestanden is TIFF. 3. Helical indexering Een spiraalvormig object kan worden geïndexeerd door twee parameters: de Bessel-order, n, en laag lijnnummer, l. Elke laag lijn in de Fourier-transformatie, zoals gekenmerkt door (n, l), komt overeen met een reeks van lijnen op het oppervlak rooster van het spiraalvormige object aangegeven met (h, k) indices, met behulp van de notatie van een 2D-rooster. Voor elke (h, k), een (n hk, l hk) laag lijn is een lineaire combinatie van twee fundamentele vectoren (n 10, l 10) en (n 01, l 01), die de n en l-waarden van de de twee belangrijkste lagen lijnen (1, 0) en (0, 1). l kan worden verkregen bij de laag regelhoogte gemeten langs Z-as in de Fourier-transformatie. De waarde van n kan worden geschat met behulp van de volgende vergelijking 10 πRr ≈ ≈ 1,1 J n | n | -0,9 …………………( 1) waar J n de Bessel-functie, die de intensiteit van de n-de laag regel bepaalt, r is de straal van de spiraalvormige object, en R is de straal van de maximale amplitude van de laag lijn. De laag regelnummer, l, is gerelateerd aan n van de selectie regel 11 l = tn + um ………………..( 2) waar T en U zijn constanten van de helix. Voor een gegeven helix, kan er precies u units in exact (of zeer nauw) t complete bochten. Box uit een relatief rechte en lange buis met een uniforme diameter van het gebruik van de EMAN programma van 12 helixboxer en sla de afbeelding in MRC-formaat. Bepaal de helical herhalen afstand, c, met behulp van een cross-correlatie gebaseerd programma, zoals 'imgccf', in de MRC-pakket 13. Het berekenen van de Fourier-transformatie, met een nieuwe doos lengte die is een integraal van de herhaling afstand, c. Kies twee belangrijkste lagen lijnen die twee fundamentele oppervlakte rooster vectoren (1,0) te definiëren en (0,1). Meet de straal van de buis, r, en de hoogte en de straal van de twee belangrijkste lagen lijnen in een Fourier transform, L 10, R 10, L 01 ​​R 01, respectievelijk (afb. 1). Bereken n 10 en n 01 volgens vergelijking (1). Omdat n-waarden zijn slechts schattingen, zijn een paar combinaties van n 10 en n 01 getest in latere stappen (zie stap 4.2) in de juiste spiraalvormige symmetrie gebruik van het programma-pakket IHRSR te vinden. Bereken de schroef symmetrie beschreven door twee reële getallen: de rotatie tussen de subeenheden (Δφ) en de axiale stijging (Δz) van de een-ster helix (n = 1). Gezien l 10, 01 l, n 10, 01 en n-waarden, kan u en t worden verkregen door het testen van een reeks van m-waarden (bijvoorbeeld, -50 <m <50) op basis van de selectie regel. Tot slot worden Δφ en Δz berekend met behulp van Δφ = 360 t / u en Δz = c / u. 4. Drie-dimensionale reconstructie Particle segmentatie Open een microfoto met spiraalvormige deeltjes, met behulp van het grafische programma Boxer, dat is een programma in de EMAN pakket. Snijd de helical deeltje in overlappende segmenten. In het bedieningspaneel van de Boxer, kies Helix-modus en de parameters voor boksen: de grootte van de doos moet groter zijn dan de diameter van de deeltjes en de waarde voor 'OLAP' moet ~ 90% van de doos grootte. Na de linkermuisknop te klikken op de beide uiteinden van de spiraalvormige deeltje, zal Boxer automatisch genereren van een reeks deeltje dozen langs de helix lengte. Bewaar boxed segmenten en hun coördinaten. De eerste 3D-reconstructie met behulp van programma's IHRSR Invert het contrast van de cryo-EM beelden en toe te passen low-pass filter 14 (optioneel) voorafgaand aan de verwerking met het iteratieve spiraalvormige werkelijke ruimte reconstructie methode (IHRSR). Open de grafische interface van IHRSR programma door te typen "Generator". Zorg voor de grafische interface met alle informatie voor de boxed deeltjes stack, inclusief de naam en het pad van de stapel, het aantal afbeeldingen in de stack, de waarden voor de parameters symmetrie, etc. Klik op de knop "Finish" om de wederopbouw script te maken, b25.spi. Gebruik een massieve of holle cilinder als een eerste referentie en kan de procedure om te fietsen totdat er geen wijzigingen in de gedefinieerde schroef symmetrie, die meestal optreedt na een paar cycli. Een recht helical symmetrie moet geven een stabiel geconvergeerd reconstructie. De reconstructie gegenereerd in de laatste cyclus zal worden gebruikt als een eerste referentie voor verdere verfijning. IHRSR voert 3D reconstructie met behulp van SPIDER-programma's. Reconstructie met iteratieve raffinement 15 De 3D-reconstructie die door IHRSR wordt nu gebruikt als een eerste referentie voor extra verfijning. Tijdens de verfijning, is de spiraalvormige symmetrie vastgesteld op Δφ en Δz, die worden bepaald door de IHRSR procedure. Bepaal de onscherp en astigmatisme aanwezig zijn in de microfoto gebruik van programma's CTFFIND3 en CTFTILT 16. Vermenigvuldig deeltje segmenten door de CTF behulp van SPIDER-programma's 17. De operatie genoemd FT in de SPIDER suite wordt gebruikt om de Fourier transformatie (FFT) van de 2D-afbeelding te berekenen. Daarna wordt de FFT vermenigvuldigd met CTF, bepaald in de vorige stappen, met behulp van de operatie genoemd MU binnen de SPIDER suite. De verkregen waarde wordt vervolgens omgekeerd weer getransformeerd tot een nieuw beeld (CTF-gecorrigeerd) in de reële ruimte met behulp van de SPIDER werking vorm, FT weer. Voer projectie matching door het vergelijken van projecties van de referentie-volumes met de CTF-gecorrigeerde beelden, het gebruik van multi-referentie-alignment. De variatie in de out-of-plane hoek is beperkt tot + / -10 ° C en bemonsterd in 1 ° stappen. Invoering van beperkingen, zoals een hoge correlatie coëfficiënten, in het vlak hoeken in de buurt van 0 ° of 180 °, en beperkte x-verschuivingen, voor de uitlijning parameters van elk segment. Onder meer bij de wederopbouw alleen die segmenten die de randvoorwaarden te voldoen. Na elke iteratieve verfijning cyclus, is een 3D-reconstructie gegenereerd met behulp van back projectie en gedeeld door som over de CTF2. Opleggen van de schuine symmetrie om een ​​symmetrized volume te genereren. De iteratieve verfijning wordt beëindigd wanneer geen verdere verbetering van de resolutie van de nieuwe 3D-reconstructie plaatsvindt. De beeldverwerking-pakket SPIDER wordt gebruikt voor het grootste deel van de verfijning stappen. Een reeks van activiteiten worden gecontroleerd door SPIDER scripts, die door de gebruiker gemaakte batch control-bestanden met sequenties van operaties en parameterwaarden. De uiteindelijke reconstructie wordt berekend met behulp van programma's in SPIDER suite. 5. Representatieve resultaten: Een HIV-1 CA A92E buis (Fig. 1a) was boxed uit en zijn Fourier transform (Fig. 1b) werd berekend voor spiraalvormige indexering. Voor laag-lijnen (1, 0) en (0, 1), l 10 = 28, l 01 = 37, R 10 = 55, R 01 = 44. Gegeven een tube straal van 211.57Å, we benaderd n 10 =- 12, n 01 = 11 (hier de willekeur was vooraf bepaald). Met een herhaling afstand van 5195.48Å, de schroef symmetrie van de buis werd bepaald als Δz = 6.8093Å, Δφ = 328,88 °. Δz en Δφ werden verfijnd om 7.1321Å en 328,86 ° met gebruikmaking van IHRSR (afb. 2a) en de eerste reconstructie is te zien in Fig. 2b. De uiteindelijke reconstructie (afb. 3), na iteratieve verfijning, verbetering van de dichtheid kaart sterk af van het eerste model berekend met IHRSR (afb. 2b). Figuur 1. Indexering van HIV-1 CA spiraalvormige buis. (A) Een enkele HIV-1 CA A92E tube beeld. Schaalbalk, 30 nm. (B) De Fourier-transformatie van de buis die in (A). De spiraalvormige indices (n 10 =- 12, n = 01 11) worden aangeduid. De pijlpunt wijst naar de laag lijn 23A resolutie. Figuur 2. Een eerste reconstructie met IHRSR. (A) Schroef symmetrie bepaling voor elke iteratieve cyclus. Δφ en Δz, uitgaande van de oorspronkelijke waarden, convergeren naar de stabiele waarden na 10 iteratieve verfijning cycli. (B) De eerste 3D-dichtheid kaart na 10 iteratieve cycli. Figuur 3. De 3D-dichtheid map na de iteratieve verfijning. (AC) De dichtheid kaart van CA buizen wordt weergegeven als drie orthogonale plakjes: parallel aan de buis-as en dicht bij het oppervlak (A), loodrecht op de buis-as (B), en parallel aan en door de buis-as (C) . Schaal van bars, 10 nm. (D) Oppervlakte weergave van de 3D-dichtheid kaart contouren op 1.8s bijvoeging van 100% vol.