هيكل HIV - 1 بواسطة جمعيات قفيصة البرد المجهر الإلكتروني وتكرارية حلزوني الإعمار الحقيقي الفضاء
Summary
توضح هذه المقالة طريقة للحصول على ثلاثي الأبعاد (3D) بنية الجزيئات helically تجميعها باستخدام البرد المجهر الإلكتروني. في هذا البروتوكول ، ونحن نستخدم تجميعات HIV – 1 قفيصة مفصلة لتوضيح الإجراء إعادة الإعمار 3D لتحقيق خريطة كثافة من تكرارية حلزونية طريقة اعادة الاعمار الحقيقية في الفضاء.
Abstract
البرد المجهر الإلكتروني (البرد م) ، جنبا إلى جنب مع معالجة الصور ، أداة قوية بشكل متزايد لتحديد بنية الجزيئات البروتينية المجمعات والتجمعات. في الواقع ، لقد تم حل واحد المجهر الإلكتروني الجسيمات (1) وثنائية الأبعاد (2D) الإلكترون البلورات 2 أصبحت روتينية منهجيات نسبيا وعدد كبير من الهياكل باستخدام هذه الأساليب. في الوقت نفسه ، وقد وضعت ومعالجة الصور ثلاثية الأبعاد (3D) إعادة بناء الأجسام حلزونية بسرعة ، وخاصة ، وتكرارية حلزونية الحقيقي الفضاء إعادة الإعمار (IHRSR) الأسلوب 3 ، والذي يستخدم أدوات التحليل واحد الجسيمات بالتعاون مع التماثل حلزونية. العديد من الكيانات البيولوجية وظيفة في أشكال حلزونية أو الخيطية ، بما في ذلك شعيرات أكتين 4 ، ميكروتثبول 5 ، 6 ألياف اميلويد ، والفيروسات فسيفساء التبغ 7 و 8 سياط الجراثيم ، وأنه يمكن التوصل إلى خريطة كثافة 3D كيان حلزونية من الإسقاط واحد الصورة ، بالمقارنة مع العديد من الصور المطلوبة لإعادة الإعمار 3D لكائن غير حلزونية ، مع أسلوب IHRSR ، التحليل البنيوي لهذه الجمعيات حلزونية مرنة والمختلين الآن يمكن بلوغه.
في هذه المقالة الفيديو ، ونحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية للحصول على خريطة كثافة 3D التجمع من البروتين حلزونية (HIV – 1 قفيصة 9 هو مثالنا) ، بما في ذلك بروتوكولات للتحضير العينة البرد EM ، وانخفاض جمع البيانات عن طريق جرعة والبرد EM ، وفهرسة أنماط الحيود حلزونية ، ومعالجة الصور وإعادة الإعمار 3D باستخدام IHRSR. مقارنة مع التقنيات الأخرى ، والبرد EM عروض الأمثل في ظل ظروف الحفاظ على عينة الأصلي القريب. هي جزء لا يتجزأ العينات في طبقة رقيقة من الجليد الزجاجي ، من خلال تجميد السريع ، وتصويرها في المجاهر الإلكترونية في درجة حرارة النتروجين السائل ، في ظل ظروف جرعة منخفضة للحد من أضرار الإشعاع. ويتم الحصول على عينة من الصور الأصلية في ظل ظروف قرب على حساب إشارة منخفضة وعلى النقيض من انخفاض في micrographs مسجل. لحسن الحظ ، تم إلى حد كبير عملية إعادة الإعمار حلزونية الآلي ، مع استثناء من فهرسة نمط حيود حلزونية. هنا ، نحن تصف نهجا للبنية حلزونية وتحديد مؤشر التماثلات حلزونية (لولبية المعلمات) من micrographs الرقمية ، وهي خطوة ضرورية لإعادة الإعمار 3D حلزونية. باختصار ، نحصل على كثافة 3D الخريطة الأولية عن طريق تطبيق أسلوب IHRSR. ومن ثم صقل هذه خريطة أولية تكرارا عن طريق إدخال قيود للمعلمات محاذاة كل قطعة ، وبالتالي السيطرة على درجة من الحرية. ويتم تحقيق مزيد من التحسن عن طريق تصحيح للالمقابل نقل وظيفة (CTF) من المجهر الالكتروني (السعة ومرحلة التصحيح) ، وتحقيق الاستفادة المثلى من التماثل حلزونية من التجميع.
Protocol
Discussion
نقدم مجموعة من البروتوكولات لتوفير نهج مباشرة للحصول على هياكل 3D الأجسام حلزونية. باستخدام الإجراءات المذكورة ، حصلنا على هيكل 3D من HIV – 1 قفيصة التجمع من صورة أنبوب واحد (176 شرائح). ويمكن تحقيق أعلى هياكل القرار بما في ذلك المزيد من البيانات الصورة.
هناك العديد من النقاط الحاسمة لجمع البيانات وتحليلها الأمثل : أولا ، أثناء إعداد عينة البرد – EM ، يجب أن تكون العينة نشف الحل بعيدا ، وترك موحدة ، طبقة رقيقة من الحل الذي هو أكثر سمكا قليلا من حجم العينة. هناك عدة طرق مختلفة لطخة العينة. لعينات الخلايا البكتيرية وأنبوبي ، مثل HIV – 1 التجمع CA ، النشاف من جانب واحد ، ولا سيما من الجانب الخلفي ، هي الأكثر ملاءمة.
الثانية ، والإنصاف من الحلزون يحتاج إلى تحديد ، وهذا لا يمكن أن تقوم به فهرسة حلزونية أو إعادة الإعمار. ومن الممارسات الشائعة هو استخدام تشميد ، تليها دوارة 18 التظليل لتحديد الطغيان. ويمكن أيضا الإنصاف أن تحدد بعد إعادة الإعمار عندما حل الخريطة كثافة عالية بما فيه الكفاية ، ونماذج 3D الذري للعناصر الفردية يجب أن تتوافق جيدا في خريطة الكثافة عندما يتم افتراض الإنصاف الصحيح. خلاف ذلك ، ينبغي أن تولى الطغيان المعاكس.
ثالثا ، ينبغي استخدام عامل تصفية فينر خلال معالجة الصور ، سواء بالنسبة لمرحلة التصحيح والسعة ، للحد من التضخيم الضوضاء. منذ CTF من صورة واحدة دائما صفر المعابر ، وفقدان جزء من المعلومات في الفضاء متبادلة. لذا ، فمن الضروري الحصول على بيانات الإسقاط متعددة شملت مجموعات لإعادة الإعمار 3D ، في تصوير كل القيم يزيل التباؤر مختلفة.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر الدكتور Gongpu تشاو كه وDanxia للحصول على الدعم الفني. نشكر الدكاترة. إدوارد Egelman وGrigorieff نيكو لتقاسم البرمجيات ومعالجة الصور. ونحن نقر أيضا الموظفين الذين يدعمون الأحياء الإنشائية البرد EM المرفق وبياولف العنقودية والشبكة في جامعة بيتسبرغ مدرسة الطب. وأيد هذا العمل من قبل وGM082251 GM085043.
Materials
| Name | Source | Comments |
| Glow-discharge device 100X | Glow-discharge device 100X | |
| Tecnai Polara F30 microscope with a Field Emission Gun | FEI, Hillsboro, OR | |
| Gatan 4K x 4K CCD camera | Gatan, Pleasanton, CA | |
| Plunge-freezing device | Home-made manual gravity plunger | |
| Quantifoil R2/1 200 mesh holely-carbon copper grids | Quantifoil Micro Tools, Jena, Germany | |
| EM software EMAN | http://blake.bcm.edu/EMAN/ | |
| EM software IHRSR | http://people.virginia.edu/~ehe2n/ | Programs available from Edward H. Egelman |
| EM software Spider | http://www.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | |
| MRC based helical processing software | http://www.riken.jp/biostrmech/index.html | Programs available from Koji Yonekura |
| CTFFIND3/CTFTILT and Real-space helical refinement software | http://emlab.rose2.brandeis.edu/software |
Referencias
- Frank, J., Radermacher, M. Three-dimensional reconstruction of single particles negatively stained or in vitreous ice. Ultramicroscopy. 46, 241-262 (1992).
- Henderson, R. Structure of Purple Membrane from Halobacterium-Halobium – Analysis of X-Ray-Diffraction Pattern. J Mol Biol. 93, 123-128 (1975).
- Egelman, E. H. The iterative helical real space reconstruction method: surmounting the problems posed by real polymers. J Struct Biol. 157, 83-94 (2007).
- Egelman, E. H., Francis, N., Derosier, D. J. F-Actin Is a Helix with a Random Variable Twist. Nature. 298, 131-135 (1982).
- Nogales, E., Whittaker, M., Milligan, R. A., Downing, K. H. High-resolution model of the microtubule. Cell. 96, 79-88 (1999).
- Jimenez, J. L. Cryo-electron microscopy structure of an SH3 amyloid fibril and model of the molecular packing. Embo J. 18, 815-821 (1999).
- Butler, P. J., Klug, A. Assembly of the particle of tobacco mosaic virus from RNA and disks of protein. Nat New Biol. 229, 47-50 (1971).
- Namba, K., Yamashita, I., Vonderviszt, F. Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature. 342, 648-654 (1989).
- Byeon, I. J. L. Structural Convergence between Cryo-EM and NMR Reveals Intersubunit Interactions Critical for HIV-1 Capsid Function. Cell. 139, 780-790 (2009).
- Toyoshima, C., Unwin, N. Three-dimensional structure of the acetylcholine receptor by cryoelectron microscopy and helical image reconstruction. J Cell Biol. 111, 2623-2635 (1990).
- Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. I. Indexing of diffraction patterns. Ultramicroscopy. 84, 1-14 (2000).
- Ludtke, S. J., Baldwin, P. R., Chiu, W. EMAN: semiautomated software for high-resolution single-particle reconstructions. J Struct Biol. 128, 82-97 (1999).
- Yonekura, K., Toyoshima, C. Structure determination of tubular crystals of membrane proteins. IV. Distortion correction and its combined application with real-space averaging and solvent flattening. Ultramicroscopy. 107, 1141-1158 (2007).
- van Heel, M. Single-particle electron cryo-microscopy: towards atomic resolution. Q Rev Biophys. 33, 307-369 (2000).
- Sachse, C. High-resolution electron microscopy of helical specimens: A fresh look at Tobacco Mosaic Virus. J Mol Biol. 371, 812-835 (2007).
- Mindell, J. A., Grigorieff, N. Accurate determination of local defocus and specimen tilt in electron microscopy. J Struct Biol. 142, 334-347 (2003).
- Frank, J. SPIDER and WEB: Processing and visualization of images in 3D electron microscopy and related fields. J Struct Biol. 116, 190-199 (1996).
- Zhang, P. J., Hinshaw, J. E. Three-dimensional reconstruction of dynamin in the constricted state. Nat Cell Biol. 3, 922-926 (2001).
