Enquêter Outer motilité cellulaire cheveux avec une combinaison de stimulation externe champ électrique alternatif et analyse d'images à haute vitesse
Summary
Une méthode fiable pour enquêter sur des cellules ciliées externes (CCE) des réponses mobiles, y compris électromotilité, la motilité lente et à la flexion, est décrite. Motilité OHC est provoqué par la stimulation par un champ électrique externe en alternance, et la méthode tire parti de l'enregistrement d'images à haute vitesse, un éclairage à base de LED, et la dernière génération de logiciels d'analyse d'image.
Abstract
CCE sont cylindriques cellules sensori situé dans l'organe de Corti, l'organe auditif dans l'oreille des mammifères intérieure. Le nom de «cellules ciliées» découle de leur bundle apicale caractéristique de stéréocils, un élément essentiel pour la détection et la transduction de l'énergie sonore 1. CCE sont en mesure de changer de forme allongée, de raccourcir et pliez-en réponse à une stimulation électrique, mécanique et chimique, une réponse motrice considérée comme cruciale pour l'amplification des signaux acoustiques cochléaires 2.
La stimulation OHC induit deux réponses différentes mobiles: i) électromotilité, alias la motilité rapide, les changements de longueur dans l'ordre de la microseconde issus de propulsion électrique des changements conformationnels dans les protéines motrices denses dans OHC membrane plasmique, et ii) la motilité lente, les changements de forme dans le milliseconde à quelques secondes d'intervalle sur la réorganisation du cytosquelette 2, 3. OHC flexion est associée à électromotilité, et résulter soit d'une distribution asymétrique des protéines motrices dans la membrane plasmique latérale, ou asymétrique stimulation électrique de ces protéines motrices (par exemple, avec un champ électrique perpendiculaire à l'axe longitudinal des cellules) 4. Stimuli mécaniques et chimiques induisent des réponses lentes essentiellement mobiles, même si les changements dans les conditions ioniques des cellules et / ou leur environnement peuvent aussi stimuler la membrane plasmique-embedded protéines motrices 5, 6. Depuis réponses OHC mobiles sont une composante essentielle de l'amplificateur cochléaire, l'analyse qualitative et quantitative de ces réponses mobiles à des fréquences acoustiques (environ de 20 Hz à 20 kHz chez l'humain) est une question très importante dans le domaine de l'audition de recherche 7.
Le développement de la nouvelle technologie d'imagerie combinant caméras vidéo à haute vitesse, des systèmes d'éclairage à base de LED, et un logiciel sophistiqué d'analyse d'image offre désormais la possibilité d'effectuer qualitatives fiables et des études quantitatives de la réponse motiles des CCEs isolées à un champ électrique externe en alternance (EAEF) 8. C'est une technique simple et non invasive qui contourne la plupart des limitations des approches précédentes 9-11. Par ailleurs, le système d'éclairage à base de LED offre une luminosité extrême, avec des effets négligeables thermique sur des échantillons et, en raison de l'utilisation de la microscopie vidéo, la résolution optique est d'au moins 10 fois plus élevée qu'avec les techniques classiques microscopie optique 12. Par exemple, avec le dispositif expérimental décrit ici, les changements de longueur de cellules d'environ 20 nm peuvent être systématiquement et de manière fiable détecté à des fréquences de 10 kHz, et cette résolution peut être encore améliorée aux basses fréquences.
Nous sommes confiants que cette approche expérimentale permettra d'étendre notre compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent la motilité OHC.
Protocol
Discussion
La méthode expérimentale présentée ici permet d'estimer les réponses OHC mobiles de la gamme kHz sans aucune restriction aux mouvements de la cellule. Différents protocoles de stimulation, d'autres marqueurs (microsphères), comme des changements dans l'orientation même de la cellule par rapport au champ électrique, permettant d'étudier de nouveaux aspects de la motilité OHC avec un niveau de détail jusque-là inaccessibles. D'autres méthodes, par exemple ceux utilisant des photodiodes <s…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les travaux pris en charge par des subventions des National Institutes Health R01DC10146/R01DC010397, NIDCD P30 DC006276 base en recherche et établissements d'enseignement supérieur. Son contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de NIH ou HEI. Les auteurs déclarent aucun conflit existant ou potentiel d'intérêts.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Leibovitz’s L-15 | Gibco | 21083 | |
| Collagenase (Type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | 1mg/mL in L-15 |
Referencias
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