강한 감각 뉴런의 Lentivirus - 중재 유전자 조작 및 시각화 생체내에</em
Summary
우리는 lentiviral 하나의 후각 감각 신경 세포의 축삭의 유전자 조작과 시각화를위한 기술 및 터미널 arborization을 제시<em> 생체내에</em>.
Abstract
정확한 후각 회로의 개발은 후각 망울 (OB)에서 시냅스 대상으로 후각 감각 뉴런 (OSN) axons의 정확한 예측에 의존하고 있습니다. OSN 축삭의 성장과 대상의 분자 메커니즘이 잘 이해되지 않습니다. 조작 유전자 발현 및 단일 OSN의 axons과 터미널 아버 형태의 시각 이후는 지금까지 도전했습니다. 지정된 시간 프레임 내에 단일 세포 수준에서 유전자 기능을 연구하기 위해, 우리는 생체내에 OSNs의 유전자 발현을 조작하는 lentiviral 기반 기술을 개발했습니다. Lentiviral 입자가 후각 상피 (OE)에 microinjection하여 OSNs로 전달됩니다. 표현 카세트는 다음 영구적으로 transduced OSNs의 게놈에 통합됩니다. 그린 형광 단백질 표현이 감염된 OSNs를 식별하고 축삭 터미널 아버 포함한 전체 형태를 설명합니다. microinjection 및 기자 탐지 사이의 짧은 처리 시간으로 인해, 유전자 기능 연구 개발의 아주 좁은 기간 내에 초점을 맞추고 있습니다. 이 방법을 통해, 우리는 몇 셋처럼 일 이내에 GFP 발현을 감지하고 한 셋처럼 개월 주사를 다음과. 우리는 노크를 다운 lentiviral microinjection하여 중재를 통해 표현과 shRNA를 모두 달성했습니다. 이 방법은 생체내에있는 단일 세포 수준에서 OSN 세포 기관과 axons 자세한 morphologies을 제공하므로 후각 개발하는 동안 후보 유전자 기능의 특성을 허용합니다.
Protocol
Discussion
OSN의 게놈의 DNA에 유전자 구조의 영구 양도에 lentivirus 결과의 Microinjection. 이러한 접근 방식은 우리가 overexpression 또는 shRNA의 중재 노크 다운을 통해 후보 유전자의 단기 또는 장기 조작을 수행할 수 있습니다. 또한, 우리는 찬란 odorant 수용체 집단의 공동 현지화을 관찰하기 위해 기존의 유전자 변형 마우스 라인에서 단일 OSNs 레이블을하실 수 있습니다. Microinjection은 OSNs의 lentiviral 도입이 필요합?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 NIH DC052256 DC006015하고, 그리고 QG 및 BS에 T32 – DC008072에 NSF 0,324,769에 의해 지원됩니다.
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.
Referencias
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