الفيروسة البطيئة بوساطة التلاعب الجيني والتخيل من العصبونات الحسية الشمية في الجسم الحي</em
Summary
نقدم تقنية للتلاعب الجيني lentiviral والتصور وحيدة الخلية العصبية الحسية الشمية محوار في محطة وتشجر<em> في الجسم الحي</em>.
Abstract
تطوير دارة الشمية دقيق يعتمد على التوقع الدقيق لمحاور عصبية حسية شمية (OSN) عصبون إلى أهدافهم متشابك في البصلة الشمية (OB). ليست هي الآليات الجزيئية للنمو واستهداف محوار OSN مفهومة جيدا. التلاعب في الجينات وتصور لاحقة من المحاور OSN واحد والتشكل على جذع محطة حتى الآن كان تحديا. لدراسة وظائف الجينات على مستوى خلية واحدة ضمن إطار زمني محدد ، قمنا بتطوير تقنية lentiviral قائم على التلاعب في الجينات OSNs في الجسم الحي. يتم تسليم الجزيئات Lentiviral لOSNs بواسطة microinjection في الظهارة الشمية (OE). ثم يتم التعبير أشرطة متكاملة بشكل دائم في جينوم OSNs transduced. الأخضر التعبير بروتين فلوري يحدد الخطوط العريضة OSNs المصابين ومورفولوجيا بكاملها ، بما في ذلك محطة جذع محور عصبي. بسبب الفترة الزمنية القصيرة بين microinjection وكشف المراسل ، يمكن أن تركز دراسات وظائف الجينات خلال فترة ضيقة جدا من التنمية. مع هذا الأسلوب ، فقد اكتشفنا التعبير GFP ضمن عدد قليل من ثلاثة أيام ، وما دامت ثلاثة أشهر بعد الحقن. لقد حققنا كل من الإفراط في التعبير وshRNA بوساطة المغلوب بنسبة microinjection lentiviral. هذا الأسلوب يوفر morphologies مفصلة الهيئات الخلية OSN والمحاور على مستوى خلية واحدة في الجسم الحي ، ويسمح بالتالي توصيف وظيفة الجين مرشح خلال تنمية حاسة الشم.
Protocol
Discussion
Microinjection النتائج الفيروسة البطيئة في نقل الجينات ثوابت دائمة في الحمض النووي الجيني OSN. هذا الأسلوب يتيح لنا تأدية معالجات قصيرة الأجل أو طويلة الأجل من الجينات عبر مرشح أو overexpression shRNA بوساطة تدق إلى أسفل. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا تسمية fluorescently OSNs واحد في خط الماوس الم…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتدعم هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة وDC052256 DC006015 ، وجبهة الخلاص الوطني 0324769 لQG – T32 وDC008072 لدرجة البكالوريوس.
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.
Referencias
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
