Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em
Summary
Biz lentiviral bir tek koku alma duyu nöron akson genetik manipülasyon ve görselleştirme tekniği ve terminal arborization mevcut<em> In vivo</em>.
Abstract
Hassas bir koku alma devre Geliştirme koku ampul (OB) sinaptik hedeflere koku alma duyu nöron (OSN) aksonlar doğru projeksiyon dayanmaktadır. OSN akson büyüme ve hedefleme moleküler mekanizmaları iyi anlaşılmış değildir. Kurgulama gen ekspresyonu ve şimdiye kadar tek OSN akson ve onların terminali çardak morfolojisi görselleştirme sonraki zorlu olmuştur. Belirli bir zaman dilimi içinde tek hücre düzeyinde gen fonksiyonu çalışma için, gen ekspresyonu in vivo OSNs işlemek için lentiviral tabanlı bir teknik geliştirdi. Lentiviral parçacıklar koku epiteli (OE) mikroenjeksiyon OSNs için teslim edilir. İfade kasetleri daha sonra kalıcı transduced OSNs genom içine entegre edilmiştir. Yeşil floresan proteini ifade enfekte OSNs tanımlayan ve akson terminali çardak de dahil olmak üzere tüm morfoloji, özetliyor. Mikroenjeksiyon ve muhabir algılama arasındaki kısa gerçekleştirme süresi nedeniyle, gen fonksiyonu çalışmaları çok dar bir süre içinde geliştirme odaklı olabilir. Bu yöntem ile, en az üç gün içinde, GFP ifade tespit ettik ve enjeksiyonu takiben üç ay kadar uzun. Biz knock-down lentiviral mikroenjeksiyon aracılı aşırı ifade ve shRNA hem de elde ettik. Bu yöntem, in vivo olarak tek hücre düzeyinde OSN hücre gövdeleri ve aksonlar detaylı morfolojileri sağlar ve böylece koku alma gelişimi sırasında aday gen fonksiyonu karakterizasyonu sağlar.
Protocol
Discussion
OSN genomik DNA gen yapıları kalıcı transferi lentivirüs sonuçları Mikroenjeksiyon. Bu yaklaşım bize aşırı ekspresyonu veya shRNA aracılı knock-down "ile aday genler kısa vadeli veya uzun vadeli manipülasyonlar ile yarabilirsiniz. Buna ek olarak, floresan odorant reseptör popülasyonları co-lokalizasyon gözlemlemek için mevcut bir transgenik fare doğrultusunda tek OSNs etiketleyebilirsiniz. Mikroenjeksiyon OSNs lentiviral transdüksiyon için gereklidir. Biz herhangi bir başarı olmadan OSNs u…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH DC052256 ve DC006015 ve NSF 0.324.769 QG ve T32-DC008072 BS tarafından desteklenmektedir.
Materials
Microinjection: Newborn mice were microinjected using a 5μL Hamilton syringe (Hamilton #7647-01) fitted with a 33 gauge needle (Hamilton #7762-06).
Immunocytochemistry Reagents: Primary antibodies: rabbit polyclonal antibody GFP (Molecular Probes# A-6455), chicken polyclonal antibody against OMP (custom) (Chen et al., 2005), guinea pig polyclonal antibody against VGlut2 (Millipore# AB2251). Secondary antibodies: Cy2-conjugated donkey anti-rabbit (Jackson Immunolab# 711-225-152), Cy3-conjugated donkey-anti-chicken (Jackson Immunolab# 703-165-155) and Cy5-conjugated goat anti-guinea pig (Jackson Immunolab# 106-175-008). Sections were mounted on glass slides with Fluoromount G (Southern Biotech# 0010-01) with 50ng/mL DAPI chromatin stain solution.
Confocal Imaging: Z-stack images were taken using an Olympus Flouview FV1000 confocal microscope and images collected and processed into 3D projections using Olympus FV10-ASW 2.01 confocal acquisition and analysis software.
Referencias
- Chen, H., Kohno, K., Gong, Q. Conditional ablation of mature olfactory sensory neurons mediated by diphtheria toxin receptor. J Neurocytol. 34, 1-2 (2005).
- Doi, K., Nibu, K., Ishida, H., Okado, H., Terashima, T. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory epithelium and olfactory bulb: a long-term study. Ann Otol Rhinol Laryngol. 114, 629-633 (2005).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295, 868-872 (2002).
- Zhao, H., Otaki, J. M., Firestein, S. Adenovirus-mediated gene transfer in olfactory neurons in vivo. J Neurobiol. 30, 521-530 (1996).
