Morris Water Maze-Test für Lern-und Gedächtnisstörungen bei Alzheimer-Modell Mäuse

1. Vorbereitung Vorbereitung der Ausrüstung Besorgen Sie sich einen kreisrunden Pool mit einem Durchmesser von 150cm und einer Tiefe von 50cm (Abb. 1). Bei der Verwendung von schwarzen Mäusen, sollte eine weiße Pool verwendet werden, wenn mit weißen Mäusen, einem schwarzen Pool verwendet werden soll. Ordnen Sie den Raum so, dass das Tier getestet kann nicht sehen, der Experimentator während der Prüfung. Dies kann mit Vorhängen oder Raumteiler erreicht werden. Legen Sie einen hohen Kontrast räumlichen Informationen über die Zimmer und / oder auf der Innenseite des Pools an einer Stelle, über der Wasseroberfläche sein würde. Legen Sie einen Durchmesser von 10cm-Plattform in den Pool – weiß für einen weißen Pool, klarem Plexiglas für eine schwarz-Pool. Füllen Sie den Pool mit Wasser, bis die Plattform 1cm über der Wasseroberfläche. Lassen Sie das Wasser auf Raumtemperatur (22 ° C) äquilibrieren. Je nach Wassertemperatur dies kann 1-3 Tage, oder alternativ heißes Wasser hinzugefügt werden, um Beschleunigung der Gleichgewichtseinstellung werden. Software Vorbereitung Kalibrieren Sie den Pool in der Computer-Software, so dass die Kamera räumliche Distanz Informationen von pixel-basierte Informationen erstellen können. Teilen Sie den Pool in 4 Quadranten. Geben Sie die Plattform-Zone als variable Zone, die mit jedem Versuch ändern können. Neues 5-Plattform Subzonen – eine in jedem Quadranten, und eine in der Mitte des Pools. Speichern Sie die Kalibrierung und nutzen es für die verbleibenden Testtage. (Siehe zB Abb. 2).. Legen Sie die maximale Probezeit als 60 sek. Wenn die Maus findet die Plattform vor dieser Zeit, Programm der Software an den Versuch zu stoppen, wenn die Plattform zu finden ist. Geben Sie das Programm zu beginnen Tracking automatisch, wenn der Experimentator beendet das Testgelände. Nutzen Sie alle "Reflexion Minimierung" Optionen Ihrer Software-Paket zur Verfügung stellt. Ihre Weglänge, Flucht-Latenz, und die Zeit in jedem Quadranten verbracht. 2. Tag 1: Sichtbare Plattform Computer-Programm Laden Sie die Pool-Kalibrierung in die Tracking-Software. Create 5 Studien mit einem inter-trial-Intervall für Ihr Experiment. Programm der Plattform Standort und Ausgangspunkt Richtung mit jedem Versuch abweichen. Siehe Tabelle 1 für ein Beispiel-Protokoll. Prüfverfahren Übertragen Sie die Mäuse aus ihren Käfigen, um das Verhalten Zimmer. Halten Sie die Maus in einem Gebiet, wo sie nicht sehen können, am Pool oder räumlichen Informationen. Lassen Sie sie an die neue Umgebung anzupassen für mindestens 30 Minuten vor dem Test. Legen Sie eine Flagge auf der Plattform, um ihre Sichtbarkeit zu erhöhen. So testen, Lift Maus aus dem Hause Käfig durch die Basis des Schwanzes. Unterstützung bei der Maus, wie Sie es auf die Prüfung Gebiet zu bringen. Anheben der Maus durch die Basis des Schwanzes, sanft die Maus in das Wasser, mit Blick auf den Rand des Beckens. Verlassen Sie sofort den Testbereich. Wenn die Maus findet die Plattform vor dem 60 sec cut-off, damit die Maus, um auf der Plattform für 5 Sekunden bleiben, dann schicken Sie es an seinen eigenen Käfig. Wenn die Maus nicht findet die Plattform, die Maus auf der Plattform und lassen Sie ihn dort für 20 sec vor der Rückgabe an seinen eigenen Käfig. Wiederholen Sie dies für alle Mäuse in der Spur. Beginnen Sie jeden weiteren Versuch mit einer anderen Plattform Standort und Ausgangspunkt Richtung, wie Sie in Ihre Software programmiert haben. Bei der Prüfung abgeschlossen ist, kehren die Mäuse ihre Wohnanlage. Mäuse sind abgetrocknet und Normothermie ist, bevor sie zu Tierhaltung wieder gesichert. In Vorbereitung für den nächsten Tag, entfernen Sie die Markierung von der Plattform und zusätzliche Wasser in den Pool zu versenken die Plattform, um 1cm unter der Oberfläche. 3. Tage 2-5: Hidden Platform Computer-Programm Laden Sie die Pool-Kalibrierung in die Tracking-Software. Create 5 Studien mit einem inter-trial-Intervall für Ihr Experiment. Programm der Plattform Standort in der gleichen Position in allen Studien und Tage bleiben, haben aber den Ausgangspunkt Richtung unterscheiden sich jedem Versuch, jeden Tag. Prüfverfahren Für schwarze Mäuse, fügen ungiftig, weiß, gepudert Temperafarbe an den Pool und gründlich mischen. Verwenden Sie genug Farbe, so dass die untergetauchten Plattform nicht sichtbar ist von der Oberfläche des Wassers. Für weiße Mäuse, sollte ein schwarzer Pool mit klarem Wasser und einer klaren Plexiglas-Plattform verwendet werden. Folgen Sie den Schritten 2.2.3 bis 2.2.6. 4. Tag 6: Probe Testversion Computer-Programm Laden Sie die Pool-Kalibrierung in die Tracking-Software. Schaffen Sie 1-Studie mit nicht-Plattform-Zone und eine Startrichtung. Die Startrichtung von der Plattform Quadranten Tage 2-5 verwendet weitesten bevorzugt. Stellen Sie die Pistenlänge bis 60 sek. Prüfverfahren Entfernen Sie die Plattform aus dem Pool. Folgen Sie den Schritten 2.2.3 bis 2.2.6. 5. Datenanalyse Für jeden Tag und jede Maus, der Mittelwert der 5 Studien einer einzigen Weglänge und Flucht Latenz für jede Testperson geben. Berechnen Sie die Summe der Fehler entsprechend. Für Tag 6, einfach sammeln die Weglänge, Flucht-Latenz, und die Zeit in der Plattform-Quadranten für jede Maus verbracht. Wenn keine Unterschiede zwischen den Gruppen am Tag 1 existieren, ist es wahrscheinlich ein Problem mit Vision statt Lernen und Gedächtnis. Nur mit der Analyse fort, wenn keine Unterschiede am Tag 1 zu sehen sind. Vergleichen Sie die Lernkurven für Tage 2-5 anhand von Statistiken für Ihre Daten eingestellt. Eine steilere Kurve schneller Aufgabe Akquisition, eine flachere Kurve stellt ein Defizit in Aufgabe Akquisition. Die Daten von Tag 2 bis Tag 5 werden mit Hilfe Anowa. Für Tag 6, vergleichen Sie den Prozentsatz der Zeit, in der zuvor gelernten Plattform Quadranten verbracht, mit Statistiken für Ihre Daten eingestellt. Ein höherer Prozentsatz der Zeit, in der Plattform Quadranten verbracht wird, als eine höhere Gedächtnisleistung interpretiert. 6. Repräsentative Ergebnisse Wir haben die Morris Water Maze Test auf Hypoxie Wirkung auf AD Pathogenese (7) und Valproinsäure (VPA) 's pharmazeutische Potenzial für AD-Behandlung (6) in transgenen AD-Modell-Mäusen zu untersuchen verwendet. Abbildung 3 ist der Vertreter Ergebnis, das wir in unserer Studie zum VPA-Effekt auf die Gedächtnisleistung in der APP23 AD-Mausmodell (6) berichtet. Am Tag 1 (sichtbare Plattform Studien), gibt es keinen Unterschied zwischen dem VPA behandelten und der Kontrollgruppe in Latenz (Abb. 3A) und Weglänge (Abb. 3A) zeigt, dass beide Gruppen ähnliche motorische und visuelle Fähigkeiten haben. Daraus können wir davon ausgehen, die Mäuse sind in der Lage, die gekennzeichnet-Plattform und die Hinweise in Umgebung zu sehen und können akzeptabel schwimmen. Seit Tagen 2-5 (Tag 1 bis 4 von versteckten Plattform Studien) das Beispiel zeigt einen Unterschied in der Flucht Latenz (Abb. 3C) und Weglänge (Abb. 3D) zwischen den Gruppen, was darauf hindeutet, dass VPA behandelten Mäuse deutlich besser als Kontrollen im Laufe der Zeit. Die Sonde Weg führt am letzten Tag (Tag 6) zeigen, dass die Anzahl der Mäuse in den dritten Quadranten, wo die versteckte Plattform zuvor gestellt wurde gereist, signifikant höher mit VPA Behandlung im Vergleich zur Kontrollgruppe (Abb. 3E) war. Diese Daten zeigen, dass VPA Behandlung verbessert die Gedächtnisleistung in APP23 Mäusen beobachtet. Abbildung 1. Ausstattung Setup für den Morris Water Maze sichtbare Plattform Testtag. Der Pool ist vom Experimentator mit Raumteiler abgeschirmt. Spatial Cues sind an den Wänden befindet, und vielleicht auf der Innenseite des Beckens gelegt, über der Wasseroberfläche, wenn gewünscht. Der Pool ist mit klarem Wasser gefüllt, mit der Plattform befinden 1cm über der Oberfläche. Eine Markierung auf der Plattform zur Verbesserung der Sichtbarkeit gelegt. Abbildung 2. Screen-Capture aus der Any-Maze ™ Video-Tracking-System demonstriert Pool Kalibrierung. Der Pool ist von oben mit einer schwarzen und weißen analogen Tracking-Kamera mit einem RTV24 Digitizer angesehen. Mehrere Zonen sind in der Software definiert und die gesamte Pool ist in 4 Quadranten unterteilt. Eine fünfte, Plattform-Zone eingegeben, können über Studien variieren, mit fünf mögliche Standorte: NW, NE, SW, SE, oder Center. Eine Kalibrierung Linie (angekreuzt Linie über Mitte) wird hinzugefügt, um damit die Software Pixel-Abständen in physische Distanzen zu konvertieren. Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für die Morris Water Maze. Die 7-monatige APP23 transgene Mäuse mit menschlichen schwedischen Mutante APP-Gens wurden nach einem Monat täglich VPA (n = 30 Mäuse) oder Vehikel-Lösung (n = 30 Mäuse) Injektionen getestet. (A) Während dem ersten Tag der sichtbare Plattform-Tests zeigte der VPA behandelt und Kontrolle APP23 Mäuse eine ähnliche Latenz auf die sichtbare Plattform zu entkommen. P> 0,05 von studentischen t-Test. (B) Der VPA-behandelten und unbehandelten Mäusen APP23 hatten ähnliche Schwimmstrecken vor der Flucht auf die sichtbare Plattform in der sichtbaren Plattform zu testen. P> 0,05 von studentischen t-Test. (C) In versteckten Plattform-Tests, behandelt VPA APP23 Mäuse zeigten eine kürzere Latenzzeit, um auf die versteckten Plattform, auf der 3. und 4. Tag, P Flucht <0,001 ANOVA. (D) Die VPA-behandelten Mäusen APP23 hatte eine kürzere Schwimmen Länge vor der Flucht auf die versteckte Plattform, auf der 3. und 4. Tag, P <0,01 durch ANOVA. (E) In der Sonde Studie am 6. Tag reiste der VPA-behandelten Mäusen APP23 in den dritten Quadranten, wo die versteckte Plattform zuvor gestellt wurde, deutlich mehr Zeit als die Kontrollen. * P <; 0,005 von studentischen t-Test. (Übernommen und nachgedruckt von The Journal of Experimental Medicine 205, 2781-2789, 2008, Rockefeller University Press, ursprünglich in J. Exp Med veröffentlicht doi:… 10.1084/jem.20081588) (6).   Tag 1 Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 5 Tag 6 Platform Lage Startrichtung Platform Wohnort: SW Startpunkt wie folgt: Keine Plattform. Versuch 1 SW S W N N E N Versuch 2 NW N S W E S Versuch 3 NE S N E W W Versuch 4 Center E E W S E Studie 5 SE W S S N N Tabelle 1. Beispiel water maze-Protokoll * * Beachten Sie, wie sowohl die Plattform Position und ab Richtung zu ändern an Tag 1, während an den Tagen 2-5 Die Plattform Position konstant bleibt, während die ab Richtung ändert. Am Tag 6, gibt es keine Plattform und einem einzigen Versuch. Die Startrichtung für Tag 6 ist von der bisherigen Plattform Standort (SW) am weitesten, so dass die Mäuse müssen in einiger Entfernung vor dem Betreten der zuvor gelernten Plattform Quadranten reisen.