Mikrosirkülasyon intravital Görüntüleme Fare Cremaster'ın kas Hazırlık

1. Fare kurulu, kas kaide, vücut kama ve superfusion çözümü Fare kurulu: şeffaf bir dikdörtgen Pleksiglas kartı (6 "geniş X 8" uzun X 3 / 16 "kalın) mikroskop sahne sığacak şekilde yapılır." Anestezi fare cerrahi hazırlanması sırasında güvenli olduğu fare board " Cremaster'ın kas. Kas kaide: şeffaf silastik kauçuk kaide, üreticinin ° talimatlarına göre karışık Sylgard 184, hazırlanır. Uygun bir kalıp, 15 mm kalınlığında x 50 mm çap çap tek Petri kabı. Sylgard blok bir jilet (Şekil 1C bakın.) Istenilen şekilde kesilir. Berrak su geçirmez silikon yapıştırıcı ince bir tabaka fare kuruluna Sylgard blok güvence altına almak için kullanılır. Faydalı ipuçları: Petri kabı içine Sylgard dökme, bir saat için bir vakum odasında gaz alma, sonra hava kabarcıkları ortadan kaldırır ve netliğini artırır. Sylgard için süre 50 ° C'de birkaç saat için bir laboratuvar fırın, bulaşık koyarak kısalır kür, gaz alma sonra. Vücut kama ve ısıtma platformu: fare altında ve kaide karşı konumlandırılmış bir kama (2 "X 4" X 15 °) kökeni kaide üzerinde Cremaster'ın kas uzanan kolaylaştırır, vücudun ileri yatırır. Yüzeyine alüminyum bir platformda birleştiren iletken ısı sağlar. Bu platform, bir DC güç kaynağı (Şekil 1A) bağlı dirençler tarafından ısıtılır. Kalibre platform sıcaklığı ~ 40 ° C ~ 37 özofagus sıcaklığı korur ° C Aksi takdirde, bir lamba radyant ısı kullanılır. Pins. Cremaster'ın kas kaide üzerinde güvenli hale getirmek için bir "L" şeklini içine bükülmüş 0.15 mm böcek pimleri, iğne hazırlanır. Fizyolojik tuz solüsyonu (PSS). Hazırlıklar ultra saf (M 18.2) H 2 O. hazırlanan bikarbonat-tamponlu PSS sürekli superfused (sulanan) Stok çözümleri 20X son çalışma konsantrasyonda hazırlanan ve 0,2 mikron filtre ile sterilize edilir. 4 saklandığında Stok çözümleri birkaç hafta için iyi kalır ° C Bikarbonat tuzları ayrı ayrı hazırlanması ve deney günü seyreltme ile karıştırılarak kalsiyum bikarbonat yağış önler. Stok tuz solüsyonu (mmol / L): 2638 NaCl, 94 KCl, 40 MgS0 4, 23.4 CaCl 2 oluşur. Stok bikarbonat 360 NaHCO 3. Bir denemenin yapıldığı gün, ilgili çözümler ölçülü balona son hacmi (genellikle belirli bir deney için 2 L) getirilir ve bir su banyosuna yerleştirilir ~ 37 ° C'de PSS değişikti% 5 CO 2 / ~ 15 dakika bir gaz dağıtıcı kullanarak% 95 N 2 ~ 7.4 pH ayarlar ve yağış önler. PSS% 5 CO 2 /% 95 N 2 deneyler boyunca sürekli kabarmış. Son çalışma çözeltisi bileşimi (mmol / L): 132 NaCl, 4.7 KCl, 1.2 MgS0 4, 2 CaCl 2, 18 NaHCO 3. 2. Anestezi ve ameliyat için hazırlık Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu onayından sonra, en az 12 hafta eski erkek fareler kullanılır. Fare pentobarbital sodyum (60 mg / kg) intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi. Frenleyici tüp ilk enjeksiyon sırasında fare güvenliğini sağlamak için yararlı kanıtlıyor. Cerrahi işlemler ve deneysel protokolleri boyunca, anestezi gibi gerekli takviyeleri (% 10-20, ilk enjeksiyon ip) (parmak veya kuyruk tutam çekilme yanıt belirtilen her 30-60 dakika) tarafından korunur. İpucu: Sulandırma pentobarbital 10 mg / ml steril serum fizyolojik enjeksiyonu, doz aşımı olasılığını azaltır. Anestezi fare ilk enjeksiyondan hemen sonra sıcak tutulmalıdır böylece ısı düzenleme uzlaşır. (Havalandırılan alüminyum sepet) ısıtma plakasının üstüne metal bir taşıyıcı fare yerleştirilmesi (~ 37 kalibre ° C) iyi çalışır. Alternatif olarak, bir ısı lambası özen fare uygun bir mesafe konumlandırmak için kullanılabilir. Uygun anestezi düzeyi (parmak veya kuyruk tutam çekilmesi eksikliği) elde edilene kadar fare her 5-10 dakika takip edilmelidir. 15-20 dakika sonra ek doz gerekebilir. Sabırlı olun ve özellikle obez veya yaşlı hayvanların aşırı dozda önlemek için dikkatli devam etmek en iyisidir. Saç dikkatle ilgili bölgelerde tıraş alt karın, bel, skrotum ve bacakları kaldırılır. Aksi Cremaster'ın kas zarar skrotum ve testisler, travmayı önlemek için özellikle dikkat alınmalıdır. Taze bir alkollü bez ile gevşek saç çıkarın. Mesane dolu ise karın duvarı üzerinden küçük bir üzüm gibi hissedeceksiniz. Cremaster'ın hazırlık deneyler sırasında idrar fare önlemek için hafif basınç mesane boşaltın. Kimwipe toplama bir etkisi süngert idrar. Bacaklarını kaide straddling kama yatarken, sırtında fare yerleştirin. Her ayağın bağlı bir ipek sütür (4-0 veya 5-0), kaide karşı kasık fare güvenliğini sağlamak için bir ip sağlar. Göğsünde gevşek yerleştirilir ve kama için güvenli bir parça bant genel vücut konumunu sürdürmektedir. Mikrodiseksiyon makas ve açılı forseps kullanarak stereomikroskopta üzerinden izlerken Cerrahi işlemler yapılmaktadır. 3. Açık Cremaster'ın kas Cerrahi hazırlık Pin skrotal kese apeks (ya sağ ya da sol tarafı) ile cilde gerginlik yere kaide yerleştirilir ve sabitlenir. PSS (34-35 ° C) ile Superfusion cerrahi alanın üzerine başlatılan ve maruz kalan doku sıcak ve nemli tutmak için diseksiyon boyunca korunur. Skrotal kese ve diğer sonraki bir vakum hattına yanında bir ucundan bir fitil yerleştirilmiş (Kimwipe yapılan), atık su PSS kaldırır. Pleksiglas kurulu yapıştırılır ve kama tamamen çevreleyen ve kaide aspire olmayan herhangi bir PSS toplamak için "hendek" olarak hizmet vermektedir mikroskop üzerine PSS kaçağını önlemek için etkili bir önlem olarak hizmet silikon bir boncuk. Skrotal kese ventral yüzeyi boyunca bir kesi yapılır. Testis karın boşluğuna Cremaster'ın kas retrakte olması durumunda, alt karın kese içine hafif bir basınç testisin yönlendirir. Testis üzerinde Cremaster'ın kas yüzeyi, şu anda tespit edilmelidir. Bağ dokusu, skrotal cilt ve Cremaster'ın kas arasındaki Cremaster'ın doku çevresindeki kas serbest dikkatle kaldırılır. Skrotal cilt hafifçe kaide proksimal kenarı arkasında retrakte ve her iki tarafında bir iğne ile güvence altına alınmıştır. Cremaster'ın kas yüzeyi dış yüzeyi daha sonra bağ dokusu temizlenir. Diseksiyonu nemlendirir bağ dokusu sırasında sürekli superfusion, görünürlük ve kaldırma kolaylaştırılması. Cremaster'ın kas apeks ile pin boyuna gerilim altında yerleştirmek için kullanılır. Vasküler arz kesintileri en aza indirmek için alınan büyük bir özen ile kas ventral uzunlamasına bir kesi ile yapılır. Bu doku hasarı 14 hazırlık çevresine yakın kan akışını dinamikleri değişmiş. Bu nedenle, en aza indirmek için bu görüntüleme ve fizyolojik çalışmalar için kullanılan veri toplama, hazırlama merkezine yakın kan damarlarını etkiler. Cremaster'ın kas epididim testisin altında ince bir bağ ile bağlıdır. Bir tarafa testis yansıtan epididim dikkatli bir şekilde ayrılmış olan bu bağ, ortaya çıkarır. Cremaster'ın kas apeks civarında küçük arter ve ven epididim bağlamak. Forseps arasında bu gemiler kapatılmasıy ve bunları birbirinden çekerek kanama en aza indirir. Testis, epididim, testis arter ve ven, (4-0 veya 5-0 ipek sütür) proksimale bağlandı ilgili kasık yağ yastığı ile birlikte kopmuş ve (orşiektomi) atılır. Alternatif olarak, testis karın boşluğuna hafifçe geri itti ve bir parça pamuk veya Kimwipe ile muhafaza edilebilir. Orşiektomi testisler karın boşluğuna geri iterek, doku mümkün travması önlemek için hizmet vermektedir. Biz işlemi 7,15 birini kullanarak Cremaster'ın mikrosirkülasyon hazırlık kalitesinde gözle görülür farklılıklar (bkz. Bölüm 3.8) bulamadı. Cremaster'ın kas dış yüzeyinde kalan bağ dokusu temizlenir ve daha sonra kaide yüzeyinde radyal yayıldı. Kenarları bozulmamış mikrosirkülasyon çizgili kas düz bir sayfa oluşturmak için 5-6 yerlerde pimleri (bkz. Bölüm 1.4) ile teminat altına alınmıştır. Tamamlanan hazırlık aşamasında, intravital bir mikroskop, (3-5 ml / dk, 34 ° C) sürekli superfused ve 30 dakika için dengelenmiş. Cremaster'ın hazırlık Dürüstlük, çeşitli kriterlere göre değerlendirilecektir. Minimal cerrahi travma ile Spontan vazomotor sesi arteriol ve venüller yapışık lökosit eksikliği tempolu akışı ile gösterilir. En hassas, duyarlı bir hazırlık indeks 5-10 dakika superfusion çözüm oksijen içeriği yükselterek arteriyollerin daralma. Bu% 21 O 2 ile değişikti tarafından yapılır (vs% 5 O 2; bkz. Bölüm 1.5,% 5 CO 2, denge N 2). Arteriollerde lökosit varlığı, yokluğu, kılcal damarların akan kırmızı kan hücreleri ve / veya venüller biriken ve çevre dokulara lökosit, doku hasarı ve inflamasyon belirtileri. 4. Cremaster'ın kas mikrosirkülasyon intravital görüntüleme Olympus MVX10 Stereo Zoom platformu dayalı özel bir mikroskop intravital görüntüleme yapılır. MVX10 mikroskop vücutMVX10 melez standı aydınlık (Köhler) görüntüleme için transillüminasyon (halojen lamba) ve floresan görüntüleme için epi-aydınlatma (cıva lambası) ile donatılmış bir monte edilir. Epi-aydınlatma kullanarak, GCaMP2 520/35 nm'de emisyon toplanan ile 472/30 nm heyecanlı. Piper Kontrol Yazılımı (SPI) ile bir kişisel bilgisayar; XR/Mega-10 yoğun bir dijital fotoğraf makinesi (SPI Stanford Fotonik, Inc.) Kullanarak; Görüntüler MV PLAPO 2XC lens (Olympus sayısal diyafram = 0.50) ile elde edilir. Bu sistem sayesinde, view (FOV) gözlenen alan 553 mm X 442 mm, 22 mm X 18 mm çeşitli olabilir. Intravital görüntüleme deneylerin tamamlanmasından sonra, anestezi fare servikal dislokasyon pentobarbital doz aşımı ile ötenazi. 5. Temsilcisi Sonuçlar Şekil 1 fare Cremaster'ın hazırlık intravital görüntüleme için Fare kurulu. A) alüminyum platformu ile Vücut kama (sarı plastik izolasyonlu) alttan izlendi. Platformun alt güvenli Isıtma dirençleri yapılan ısı sağlar. B) ısıtma platformu, bir plastik takoz aittir. C) vücut kama cerrahi ve intravital mikroskop sahne sonraki transfer için bir Pleksiglas tahta üzerine yerleştirilir. Sylgard kaide kırmızı ok ile gösterilir. Su geçirmez silikon boncuk mikroskop damlamasını engelleyen intravital prosedürü sırasında sızıntı olabilir herhangi bir çözüm içeren tüm hazırlık çevreler. Şekil 2: widefield görüntüleme Özel MacroZoom mikroskop . A) MVX10 mikroskop XR/Mega-10 ICCD kamera ile vücut (Olympus) (Stanford Fotonik) trinoküler port üzerine monte edilmiş. B) mikroskop vücut Close-up. (A) Zoom kontrolü (0.63 6.3x), (b) filtre tekerleği, (c) görüntü doubler'i (25X optik büyütme ile NA = 0.50). C) Askat aydınlık (Köhler) aydınlatma (Kondenser NA = 0.55, Çalışma Mesafesi = 27 mm) için kondansatör. Şekil 3 fare Cremaster'ın hazırlık tamamlandı. Sıcak plastik kaplamalı alüminyum platform (sarı) yatar pozisyonda anestezi altında fare. Vücut pozisyonu bant ile sabitlenir. Cremaster'ın kas şeffaf silastik lastik kaide üzerinde radyal yayıldı ve kenarlarında tutturulmuş. Superfusion çözüm plastik damlatıcı (beyaz ok) ile proksimal sonunda tanıtıldı. Bir vakum hattı (beyaz ok ucu) Kimwipe fitil yoluyla çözüm kaldırır. İki mikropipetler doku ve ipuçları ile yer gösterilir. Cremaster'ın kasının alt kenarında bir referans elektrot (gümüş tel) güvence altına alınmıştır. Şekil 4 endotelde GCaMP2 arterioler ağları ifade görselleştirmek için büyütme aralığı anlama. A)) Floresan ve B aydınlık görüntü, video monitör toplam = 42x büyütme için 3.2x optik büyütme alınır. [Görüş alanı (FOV) = 4375 x 3470 mm. Ölçeği bar = 500 mm. Bu büyütme Çalışmak istenilen noktada mikropipetler yerleştirme kolaylaştırır. Toplam büyütme 6.4X optik büyütme alınan C) Floresan ve D) aydınlık görüntü = 83x (FOV = 2.200 x 1.759 mm). Ölçeği bar = 200 mm. E) Floresan ve F) aydınlık görüntü toplam büyütme 12.6X optik büyütme = 165X (FOV = 1.100 x 885 mm). Ölçeği bar = 100 mikron. G) görüntü katlayıcı, optik büyütme = 25.2X. Ölçek çubuğu = 50 mm.