العضلة المشمرة ماوس التحضير لتصوير Intravital للدوران الأوعية الدقيقة
Summary
ووصف إعداد التصور والأنسجة لمعالجة التجريبية للدوران الأوعية الدقيقة الحية. في الفئران الذكور تخدير ، يتم إعداد رقيقة ، والعضلات المشمرة أوعية دموية للغاية لintravital المجهري لدراسة شبكات الاوعية الدموية الدقيقة بما في ذلك الشرايين والشعيرات الدموية والأوردة. ويتم تكييف بسهولة التحضير لهذه الجرذان والفئران البيضاء.
Abstract
في جميع أنحاء الجسم ، والحفاظ على التوازن يتطلب امدادات ثابتة من الأوكسجين والمواد المغذية يصاحب ذلك مع إزالة الأيضية والمنتجات. ويتحقق هذا التوازن عن طريق حركة الدم من خلال دوران الأوعية الدقيقة ، والذي يشمل فروع أصغر من إمدادات الأوعية الدموية في جميع الأنسجة والأعضاء. الشرينات فرع من الشرايين على شكل شبكات للتحكم في توزيع وحجم الدم المؤكسج تصب في العديد من الشعيرات الدموية المرتبطة ارتباطا وثيقا مع خلايا متنية. الشعيرات الدموية توفر مساحة كبيرة لتبادل diffusional بين خلايا الأنسجة والدم. الوريدات جمع النفايات السائلة الشعرية وتتلاقى مع عودتهم امؤكسج الدم نحو القلب. لمراقبة هذه العمليات في الوقت الحقيقي يتطلب نهجا تجريبيا لتصور والتلاعب دوران الأوعية الدقيقة الحية.
وقد استخدم لأول مرة في عضلة المشمرة الجرذان كنموذج لدراسة التهاب الأنسجة باستخدام المجهر والإلكترون 1،2 آخر بعد الوفاة. التحقيق الأول في تقرير المجراة من الفئران المعرضة سليمة العضلات المشمرة ردود الاوعية الدموية الدقيقة على الأدوية فعال في الأوعية باستخدام الضوء ينعكس 3. مهما كانت محدودة انحناء في العضلات وعدم وجود إنارة ركزت على فائدة من هذا الإعداد. واستتبع فتح فتحا كبيرا في العضلات ، وفصلها من الخصية وانتشاره شعاعيا كورقة للشقة تضوء تحت المجهر المركب 4. في حين أظهرت أن يكون إعداد قيمة لدراسة علم وظائف الأعضاء للدوران الأوعية الدقيقة في الجرذان والفئران البيضاء 5 6 ، وقد ثبت في العضلة المشمرة الفئران 7 مفيدة بشكل خاص في تشريح مسارات الخلوية تشارك في تنظيم وظيفة الاوعية الدموية الدقيقة 11/08 في الوقت الحقيقي والتصوير من بين الخلايا إشارات 12.
مشتق من العضلة المشمرة عضلات البطن الداخلية المائل والعرضي والخصيتين ينزل من خلال القناة الإربية 13. إنه يساعد على دعم (باليونانية : المشمرة = رباط الجورب) والحفاظ على درجة حرارة الخصيتين. كما هو موضح هنا ، هو إعداد ورقة والعضلات المشمرة شقة رقيقة لقرار الضوئية المعلقة. مع الحفاظ على الماوس في درجة حرارة الجسم ثابتة وطائرة من التخدير ، وإعداد الجراحية ينطوي على تحرير العضلات من الأنسجة المحيطة بها ، والخصيتين ، ونشر ذلك على قاعدة التمثال من المطاط silastic شفافة وتأمين الحواف مع دبابيس الحشرات بينما لري بشكل مستمر مع محلول ملحي الفسيولوجية . ويستخدم هذا البروتوكول الفئران المعدلة وراثيا في التعبير عن GCaMP2 الخلايا البطانية تصلب. GCaMP2 المرمزة وراثيا هو مؤشر الكالسيوم الفلورسنت 12 الجزيء. Widefield التصوير والكاميرا كثف الجهاز المسؤول إلى جانب تمكين في الدراسة المجراة من إشارات الكالسيوم في بطانة تصلب.
Protocol
Discussion
نحن هنا وصف العضلة المشمرة فتح في إعداد الماوس لرصد دوران الأوعية الدقيقة في الجسم الحي. وعلى غرار هذا الإجراء بعد "فتح" إعداد المشمرة وصف لأول مرة في الفئران 4. ويمكن أن يكتمل مع الممارسة العملية الجراحية بالكامل في أقل من 1 ساعة. وبراعة هذا الإعداد يسمح لمجموعة متنوعة من المعالجات التجريبية وتكييفها بسهولة للهامستر وكذلك الفئران ، وتمكين مجموعة متنوعة من نماذج تجريبية لدراستها بطريقة مماثلة. ويقتصر إعداد للحيوانات من الذكور ، وينبغي إجراء قياسات نحو وسط النسيج ، وتجنب المناطق المتضررة بالقرب من حواف العضلات 14. وينبغي أيضا أنه يجب الاعتراف بأنه ، في حين يتم تغيير توزيع الضغط والتدفق عندما يتم قطع الأوعية ربط عضلة المشمرة 16 ، microvessels تظل استجابة ومناسبة لجمع البيانات استنساخه. القيد الرئيسي على الرؤية ودوران الأوعية الدقيقة في العضلات المشمرة هو تراكم النسيج الضام مثل الحيوانات الناضجة وزيادة في الحجم ، ولا سيما في الفئران ولكن أيضا في الهامستر. كذلك ، الحيوانات الحصول على الدهون ، فإنه يصبح من الصعب السيطرة عليها بسبب التخدير بنتوباربيتال محبة للدهون ويمكن استيعابها في الأنسجة الدهنية. أفضل طريقة للمضي قدما هو من خلال التحلي بالصبر مع ضمان الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان ° ~ في 37 درجة مئوية بينما المروية الأنسجة تتعرض باستمرار مع PSS.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم البحوث في المختبر المؤلفين من المعاهد الوطنية للصحة منح R37 – HL041026 ، R01 – R01 HL086483 وHL056786 – (SSS) وHL097463 – F32 و- T32 AR048523 (PB) من خدمة الولايات المتحدة الصحة العامة.
Materials
| Name of the reagent or device | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | S233 | |
| Nembutal Sodium Solution | Lundbeck | NDC 67386-501-55 | Also referred to as sodium pentobarbital |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | Alternate: adjustable 12V DC power supply |
| Series 20 platform heater kit RH-2 | Warner Instruments | 64-0274 | Requires custom-built aluminum plate |
| Mega-10 Camera | Stanford Photonics | XR/Mega-10 | |
| MVX10 | Olympus | ||
| MV PLAPO 2XC lens | Olympus | ||
| MVX10 hybrid stand | Leeds | LBX-Hybrid | |
| Piper Control Software | Stanford Photonics | Program for Mega-10 camera | |
| Stereo Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Waterproof Silicone Sealant (Clear) | General Electric | 47970-72643-LW5000 | Other clear silicone sealants also work |
| 60 x 15mm Petri Dish | Fisher | 08-757-13A | |
| Sylgard | Dow Corning | 184 | |
| Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
| GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
| Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
| Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean after each use |
Referencias
- Majno, G., Palade, G. E. Studies on inflammation. 1. The effect of histamine and serotonin on vascular permeability: an electron microscopic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 571-605 (1961).
- Majno, G., Palade, G. E., Schoefl, G. I. Studies on inflammation. II. The site of action of histamine and serotonin along the vascular tree: a topographic study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 11, 607-626 (1961).
- Grant, R. T. Direct Observation of Skeletal Muscle Blood Vessels (Rat Cremaster). J. Physiol. 172, 123-137 (1964).
- Baez, S. An open cremaster muscle preparation for the study of blood vessels by in vivo microscopy. Microvasc. Res. 5, 384-394 (1973).
- Bohlen, H. G., Gore, R. W., Hutchins, P. M. Comparison of microvascular pressures in normal and spontaneously hypertensive rats. Microvasc. Res. 13, 125-130 (1977).
- Klitzman, B., Duling, B. R. Microvascular hematocrit and red cell flow in resting and contracting striated muscle. Am. J. Physiol. 237, 481-490 (1979).
- Hungerford, J. E., Sessa, W. C., &, S. e. g. a. l., S, S. Vasomotor control in arterioles of the mouse cremaster muscle. FASEB J. 14, 197-207 (2000).
- Figueroa, X. F., Paul, D. L., Simon, A. M., Goodenough, D. A., Day, K. H., Damon, D. N., Duling, B. R. Central role of connexin40 in the propagation of electrically activated vasodilation in mouse cremasteric arterioles in vivo. Circ. Res. 92, 793-800 (2003).
- Wolfle, S. E., Schmidt, V. J., Hoepfl, B., Gebert, A., Alcolea, S., Gros, D., de Wit, C. Connexin45 cannot replace the function of connexin40 in conducting endothelium-dependent dilations along arterioles. Circ. Res. 101, 292-1299 (2007).
- Milkau, M., Kohler, R., de Wit, C. Crucial importance of the endothelial K+ channel SK3 and connexin40 in arteriolar dilations during skeletal muscle contraction. FASEB J. 24, 3572-3579 (2010).
- Bagher, P., Duan, D., Segal, S. S. Evidence for impaired neurovascular transmission in a murine model of Duchenne Muscular Dystrophy. J. Appl. Physiol. 110, 601-610 (2011).
- Tallini, Y. N., Brekke, J. F., Shui, B., Doran, R., Hwang, S. M., Nakai, J., Salama, G., Segal, S. S., Kotlikoff, M. I. Propagated endothelial Ca2+ waves and arteriolar dilation in vivo: measurements in Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice. Circ. Res. 101, 1300-1309 (2007).
- Grant, R. T. The effects of denervation on skeletal muscle blood vessels (rat cremaster). J. Anat. 100, 305-316 (1966).
- Proctor, K. G., Busija, D. W. Relationships among arteriolar, regional, and whole organ blood flow in cremaster muscle. Am. J. Physiol. 249, H34-H41 (1985).
- Bagher, P., Segal, S. S. Regulation of blood flow in the microcirculation: Role of conducted vasodilation. Acta Physiol. , (2011).
- Hill, M. A., Simpson, B. E., Meininger, G. A. Altered cremaster muscle hemodynamics due to disruption of the deferential feed vessels. Microvasc. Res. 39, 349-363 (1990).
