Spinal Kordonlar nörotropik Mouse Hepatit Virüs ile Etkilenmiş Fare Fare Nöral Kök Hücre Transplantasyon Cerrahi

1. Hazırlık Xylazine ketamin çözüm (Ketamin kontrollü bir maddedir. Ayrıntılı kayıtları tutulur ve çözümleri, güvenli, kilitli bir yerde muhafaza edilmelidir) hazırlayın. Ekipmanı temizleyin ve sterilize edin. Aseptik maddesi ile silme ve ardından steril kağıt havlu ile kapsayan cerrahi alanında hazırlayın ve mikromanipülatör kurmak. 2. Hücre nakli için hazırlık Fare başına düşen sadece 250,000 hücreleri nakledilen olmasına rağmen hücreler, 100.000 hücre / É l bir konsantrasyon yeniden bekletildi ve olmalıdır, hücrelerin aşırı şırınga yükleme amacıyla hücrelerini aldıktan fare başına en az 300.000 hücre hazırlamak için gereklidir. 50 ml konik flakon HBSS içinde 3 kez nakledilen hücrelerin yıkayın. Final spin önce hücreleri saymak. Sonra aşağı final spin, süzün HBSS ve damlacıkları pelet ulaşmasını önlemek için konum aşağı ters flakon terk. UV-ışınlanmış, steril Kimwipe Kuru iç duvarları. Pelet kurumasına izin vermeyin. Yavaş yavaş, tüp dik Holding ve çok ince HBSS yarısı son istenen birimde hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin. Bir pipet süspansiyon çoğunluğu pipetleme ve ardından tüm süspansiyon pipet ucu kadar pipetter çevir ayarlayarak toplam hacmi ölçün. Bu ne kadar daha HBSS istenen konsantrasyon için gerekli size söyleyecektir. HBSS ekleyerek istenilen miktarda hacim kazandırın. Buz üzerinde geri yerleştirin. 2 saat daha uzun buz gerekiyorsa hücre canlılığı kontrol edin. 3. Cerrahi ve transplantasyon için farelerin hazırlanması Intraperitoneal ketamin (100mg/kg) ve ksilizin ~ 100 ul dozda (10mg/kg) veya eşdeğer bir anestezik enjeksiyon ile fare anestezisi. Cerrahi hazırlık dikilmesi için tüm işlem 30-40 dakika sürer. (Opsiyonel: tanımlanmasını sağlamak için her fare kuyruk numaralı, renkli bant uygulamak) Boyun alt sırt fare dorsal bölgede Tıraş ve elektrik kesme makineleri ile ikili orta hatta 2 cm uzanan. Saç (bölge üzerinde birkaç kez gitmek için gerekli olabilir) mümkün olduğunca yakın kesilmelidir. Kalan saç kaldırmak için bir gazlı bez ile tüy dökücü krem ​​(Nair) ince bir tabaka uygulayın uçlu bir aplikatör. 1-2 dakika sonra, kapalı Nair, sabunlu su ile hafifçe ıslatılmış gazlı bez ile silin. Hazırlanan alan sonraki cerrahi işlem sırasında yara alabilir, herhangi bir saç sokak parçaları olmadan çıplak deri temiz olmalıdır. Hazırlanan alan iyodür solüsyonu ile sterilize edin. 4. Laminektomi Prosedürü boyunca eldiven Sıkça değiştirebilir ve / veya sterilize edin. Kafası (sağ elle) sol işaret fare dorsal tarafına yerleştirin. Kısırlık sağlamak ve sadece traş alana maruz kaldığı hayvan Örtüsü. Laminecomy sitesi T12 hakkında torasik vertebra T8 kapsayan üzerinde dikey bir kesi (1.3cm) olun. Sol elinde düzenlenen Graefe forseps ile sıkıca omuriliğe T9 (Şekil 1A), güvenli ve omurga eğriliğinin abartmak için fareyi yukarı kaldırın. T10 ve T11 arasında kavşak, iki dikenli çıkıntılar arasındaki boşluğu puan neşter kullanın. Ayrıca kemik açığa çıkarmak için (Şekil 1B, C) ​​dikkatle uzakta kas tabakası hurdaya kavşak maruz kalmaktadır. Lamina ve pedikül küçük snips etrafında açık kas daha makas kullanın. Bu omurlar arasındaki küçük bir alan açılacaktır. Yavaş yavaş ve ince makas bu boşluğu içine bir bıçak takın ve pedikül snip. Makas eğriliği her zaman kabloyu uzak, yatay konumlandırılmış emin olun. Diğer tarafta tekrarlayın. (Bkz. Şekil 1D, E) Kabloyu maruz lamina kaldırın ve dikkatli bir şekilde kapalı snip. Arkasında herhangi bir ücretsiz veya sivri kemik parçaları bırakmamaya emin olun. (Bkz. Şekil 1F) Enjeksiyon için, önce herhangi bir kan steril pamuklu çubukla temizleyin. 5. Hücre enjeksiyonu Hamilton şırınga iğne iğne somunu takın ve onlara temiz su, sonra% 70 etanol ile birkaç kez ateş basması, ve nihayet HBSS. Su,% 70 etanol veya HBSS her doldurduktan sonra piston yerleştirin. Hamilton şırınga pistonu çıkarmadan ve iğne somunu gevşeterek ve iğne, backpressure önlemek için şırınga uzak çekerek hücre yükleme için hazırlayın. Iğne ve somun dikkatli kullanımı, steril eldiven ile yapılır emin olun. Pipet içine hücre 15μl Yük ve ucu şırınganın içine hücreleri yüklemek için şırınga arka ucunu sıkıca basın. 5mm hakkında pistonu takın ve ardından iğne somununu sıkın. Piston un sıkıptil bazı hücre süspansiyonu iğne çıkmadan görülür. Şırınga içinde kabarcıklar vardır ve yerçekimi ile bir degrade hücreleri önlemek için yatay pozisyonda şırınga uzandı emin olun. T8 ve T9 (Şekil 2B, C) ​​dikenler bağlayan spinalis dorsi laminectomized fare basılı tut. Kelepçe, farenin ön pençeleri havada ve arka pençeleri Şekil 2A ve 2B olarak hafifçe böylece steril kağıt havlu bir platform dokunarak sol (düşey) mikromanipülatör kol hemostat . Takın, sağ mikromanipülatör kol (70 ° açıyla) şırınga ve şırınga sıkma önce mümkün olan en düşük pozisyona kaydırın. Kağıt havlu karşı kuyruk iğneleyerek ve yavaş yavaş şırınga (Şekil 2B) alt fare sabitleyin. Kabloyu doğru iğne Alt ve dorsal orta hat (Şekil 2C) ile ters yarımkürede içine iğne 1mm eklemek . Iğne ucu merkezi kanalına yakın gri cevherde olmalıdır. 2.5μl hücrelerin yavaş yavaş enjekte. 1μl / 5 saniye hızında enjekte edilir. Hücreler enjekte ettikten sonra, iğne kablosunun her 10 saniye kadar bir seferde 10 saniye bekleyin ve iğne bir dönüş onda geri çekin. Hücre süspansiyonu mümkün efflux dikkat edin. Şırıngaya hızla geri çekin ve mikromanipülatör kolundan ayırmak. Şırınga yatay aşağı yatırın. Fare ve dikiş tabloya transfer bırakın. Şırınga boşaltılır kadar her fare için 5,7-5,14 adımları tekrarlayın. Araçları (sterilizatör) ve hayvanlar arasındaki iğne (etanol ile silerek) sterilize edin. Hücreler atılır ve topaklanma görülebilir yeniden. Yükler arasında adım 5.1 olarak şırınga temizleyin. 6. Dikişler ve post-op bakım Kesi dikin. Sütür iğne kesi her iki tarafta yüzeysel fasya içine eklenir. Konu böylece kaldırılır lamina yerinde maruz omurilik kapsayan, (Şekil 3A) birlikte yüzeysel fasya çekerek üzerinden sinirli. , Deri ya da arka iskelet kası bağlı deri kas sütür etmeyin. Iğne tutucu, üç knot oluşan ve iplik düğüm mümkün olduğunca yakın olarak kesilmiş yaklaşık 1 / 2 ". Bırakarak aracılığıyla tüm konu çekin. 02:58 zımba (kesi büyüklüğüne bağlı olarak) deri (Şekil 3B) uygulayarak kesi kapatın. Dikkatlice altta yatan kas zımbalama önlemek için fare uzak cilt çekin. 26G3 / 8 iğne kullanarak alt kutanöz kesi uzak alt sırt, 0.5 ml Laktatlı Ringers enjekte edilir. Kendi kafesine geri koyun fare. Anestezi altında cerrahi sitesi ve kafesli yataklar arasındaki temas kaçınarak, fare, kafese yana yatık olmalıdır süre rahat nefes sağlamak. Kafesler ısıtma pedleri konulmalıdır. Anestezi, kanama azalır sağlamak için kapalı giyer sonra Fare izlenir, dikiş kapalı kalır ve bu farelerin ameliyat öncesi hareketlilik dönmek. Analjezik buprenorfin (0.05-0.1 mg / kg) aşağıdaki cerrahi ile farelerin bir kez davranın. Bozulmuş farelerin yiyecek ve su yeterli erişimi olduğundan emin olun: 3.5 inç emzikli ve elle beslenen su ve / veya yüksek kalorili besin takviyesi (Nutri-Cal, Tomlyn) yürüyemez fareler uzun su şişeleri ile donatılmıştır. 7. Temsilcisi Sonuçlar: Istenen sonuçları enjeksiyon sırasında hücre süspansiyonu efflux eksikliği ve prosedürü takip omurilik sağlam görünüşü tanımlanabilir olacaktır. Bu amaçla, laminektomi sırasında ve enjeksiyon sırasında farenin omurga üzerinde parlak ve direkt aydınlatma için hayati önem taşımaktadır. Optimal aydınlatma, fiber optik aydınlatma (Şekil 2A) tarafından kolaylaştırılır . Şekil 1 – Laminektomi (A) Bir omur T9 sağlam puan mikro makas girişini kolaylaştırmak için T10 ve T11 arasında bistüri ile omurga (B, C), Graefe forseps ile tutulur. (D), T10 ve T11 (oklar ve içerlek, E) arasında dikkatlice uzayda mikro makas slayt ve dorsal lamina serbest bırakmak için her iki tarafta pediküller (tire, E) kesmek. (F) rostrally lamina yukarı kaldırın ve kesti. Şekil 2. NSC'lerde enjeksiyon (A), 70 açıyla sağ kol, sol kol ve Hamilton şırınga bağlı fare tutarak hemostat mikromanipülatör genel kurulum. (B) hemostat, T8 ve T9 dikenler bağlayan spinalis dorsi tutun. (C) iğne, t ile indirilir.o orta hat ve merkez kanalın proksimalinde ters yarımkürede gri madde, içine. Şekil 3. Dikişler ve yaranın kapanması (A) Dikişler kesi her iki tarafta yüzeysel fasya uygulanır. (B) gerektiği gibi 2-3 zımba ile (3 gereken bir yara üzerinde gösterilen bir elyaf) kesi kapatılır.