Transplante de Células-Tronco cirúrgica do rato Neural na medula espinhal de camundongos infectados com o vírus da Hepatite neurotrófico rato

1. Preparação Prepare xilazina-cetamina solução (ketamina é uma substância controlada. Registros detalhados devem ser mantidos e soluções armazenadas em um local seguro e trancado). Limpar e esterilizar equipamentos. Prepare área da cirurgia, limpando com o agente de assepsia e, em seguida, cobrir com papel toalha estéril, e configurar o micromanipulador. 2. Preparação de células para transplante As células devem ser ressuspendidas a uma concentração de 100.000 células / l E e, apesar de apenas 250.000 células são transplantadas por mouse, um excesso de células é necessário para fins de seringa de carga (preparar pelo menos 300 mil células por camundongo que receberam células). Lave as células a serem transplantadas 3 vezes em HBSS num frasco de 50 ml. Contar as células antes do spin-final. Após a centrifugação final para baixo, e deixar decantar HBSS frasco em posição de cabeça para baixo para evitar que gotas de alcançar o sedimento. Seca paredes interiores com um UV-irradiados Kimwipe, estéril. Não permita que o pellet para secar. Segurando o tubo na posição vertical, lenta e delicadamente ressuspender as células em metade do volume final desejado de HBSS. Medir o volume total por pipetagem a maioria da suspensão em uma ponta da pipeta e então ajustando o dial na pipeta até a suspensão inteira está na ponta da pipeta. Isso vai te dizer o quanto HBSS mais é necessário para a concentração desejada. Traga de volume para a quantidade desejada, adicionando HBSS. Coloque de volta no gelo. Verificar a viabilidade das células se deve ser sobre o gelo por mais de 2 hrs. 3. Preparação de ratos para a cirurgia e transplante Anestesiar o rato por injeção intraperitoneal de ketamina (100mg/kg) e xilazina (10mg/kg) em ~ 100 mL doses ou por um anestésico equivalente. Todo o processo de preparação cirúrgico para sutura terá de 30-40 minutos. (Opcional: aplique fita numerada, colorido para a cauda de cada rato para assegurar a identificação) Raspar a área dorsal do mouse a partir da parte inferior das costas para o pescoço, e estendendo dois centímetros da linha média bilateral, com tosquiadeiras elétricas. O cabelo deve ser cortado o mais próximo possível (pode ser necessário para ir sobre a área várias vezes). Para remover os pêlos restantes, aplique uma camada fina de creme de depilação (Nair) com uma gaze aplicador derrubado. Depois de 1-2 minutos, limpe Nair off com gaze umedecida levemente com água e sabão. A área preparada deve ser limpa a pele nua, sem peças perdidas de cabelo que poderiam entrar na ferida durante o procedimento cirúrgico subseqüente. Esterilizar a área preparada com solução de iodeto. 4. Laminectomia Mudam freqüentemente e / ou esterilizar as luvas durante o procedimento. Posição ao lado do mouse dorsal com a cabeça apontando para a esquerda (se você for destro). Drape animais para garantir a esterilidade e que apenas a área raspada está exposto. Faça uma incisão vertical (~ 1,3 cm) sobre o local laminecomy spanning de cerca de vértebras torácicas T8 a T12. Com a pinça zu na mão esquerda, prender firmemente a coluna vertebral em T9 (Figura 1A) e levante o mouse até a exagerar a curvatura da coluna vertebral. Use o bisturi para marcar a junção entre T10 e T11, o espaço entre as duas saliências espinhosas. Ainda expor a junção com cuidado a demolição da camada muscular para expor o osso (ver Figura 1B, C). Use a tesoura para mais músculo clara distância da lâmina e em torno do pedículo com snips pequenos. Isto irá abrir um pequeno espaço entre as vértebras. Lenta e delicadamente inserir uma lâmina da tesoura para essa lacuna e snip do pedículo. Certifique-se a curvatura da tesoura é sempre posicionados lateralmente, longe do cabo. Repita no outro lado. (Ver Figura 1D, E) Levante a lâmina para expor o cabo e cuidadosamente snip-lo. Não se esqueça de deixar qualquer fragmentos de ossos livre ou irregulares para trás. (Ver Figura 1F) Antes da injeção, limpar o sangue para fora com cotonetes estéreis. 5. Injeção de células Coloque a agulha com agulha porca para a seringa Hamilton e limpá-los através de lavagem com água várias vezes, então 70% de etanol e, finalmente, HBSS. Inserir êmbolo após cada enchimento com água, etanol 70%, ou HBSS. Prepare a seringa Hamilton para carregar celular através da remoção do êmbolo e soltando a porca agulha e puxando a agulha para longe da seringa para evitar contrapressão. Garantir que a manipulação cuidadosa da agulha e porca é feito com luvas estéreis. Carga 15μl de células em pipeta ponta e pressione a ponta firmemente na extremidade traseira da seringa para carregar as células dentro da seringa. Insira o êmbolo aproximadamente 5mm e, em seguida, apertar a porca da agulha. Deprimem êmbolo unaté alguns da suspensão de células foi visto saindo da agulha. Certifique-se que não há bolhas na seringa e colocar a seringa na posição horizontal para evitar que as células de fazer um gradiente de gravidade. Agarrar o mouse laminectomized pelo músculo spinalis dorsi conectando os espinhos de T8 e T9 (Figura 2B, C). Prender o hemostat para o braço esquerdo micromanipulador (vertical) para que as patas da frente do rato estão no ar e suas patas traseiras tocando levemente uma plataforma de toalhas de papel estéreis, nas Figuras 2A e 2B. Conecte a seringa no braço direito micromanipulador (em um ângulo de 70 °) e deslize a seringa na posição mais baixa possível, antes de aperto. Estabilizar o mouse fixando sua cauda contra as toalhas de papel e abaixe lentamente a seringa (Figura 2B). Abaixe a agulha em direção ao cabo e insira a um milímetro agulha no hemisfério oposto através da linha média dorsal (Figura 2C). A ponta da agulha deve ser na substância cinzenta perto do canal central. Injecte lentamente 2.5μl de células. Injetar a uma taxa de 1μl / 5 segundos. Depois de injetar as células, espere uns 10 segundos e retirar a agulha 1 / 10 de uma volta em um momento cada 10 segundos até que a agulha está fora do cordão. Preste atenção ao efluxo possível de suspensão celular. Rapidamente retirar a seringa e retire-a do braço micromanipulador. Lay a seringa horizontalmente. Solte o mouse e transferência para a mesa sutura. Repita os passos 5,7-5,14 para cada rato até que a seringa é esvaziada. Esterilizar as ferramentas (no esterilizador) ea agulha (limpando com álcool) entre os animais. Descartar pilhas e recarregar se aglomeração é visível. Limpe a seringa como no passo 5,1 entre as cargas. 6. Suturas e pós-operatório de cuidados Suturar a incisão. Agulha de sutura é inserida na fáscia superficial em ambos os lados da incisão. O fio é amarrada através de, puxando fáscia superficial juntos (Figura 3A), cobrindo assim a medula espinal exposta no local da lâmina removido. Não sutura do músculo cutâneo ligado à pele ou do músculo esquelético das costas. Puxe a linha através de todo, deixando cerca de 1 / 2 ". Usando o porta-agulha, três nós são formados e linha é cortada o mais próximo do nó possível. Fechar a incisão através da aplicação de 2-3 grampos (dependendo do tamanho da incisão) para a pele (Figura 3B). Puxe cuidadosamente a pele longe do mouse para evitar grampear o músculo subjacente. Usando um 26G3 / 8 agulha injetar 0,5 ml de Ringer Lactato de sub-cutânea na região lombar longe da incisão. Colocar o mouse de volta em sua gaiola. Para garantir que ele é capaz de respirar confortavelmente enquanto sob anestesia, o mouse deve ser colocado de lado na gaiola, evitando o contato entre o local da cirurgia e roupa de cama gaiola. Gaiolas devem ser colocados em almofadas de aquecimento. Ratos são monitorados após a anestesia desgasta fora para garantir subsídios sangramento, suturas permanecem fechadas, e que os ratos voltar ao pré-cirurgia de mobilidade. Tratar ratos um tempo com a buprenorfina analgésico (0,05-0,1 mg / kg) após a cirurgia. Garantir camundongos deficientes têm acesso suficiente a alimentos e água: garrafas de água estão equipados com bicos estendida 3,5 polegadas e ratos que são incapazes de andar de mão são alimentados de água e / ou de alto teor calórico suplemento dietético (Nutri-Cal, Tomlyn). 7. Resultados representativos: Resultados desejados será identificável pela falta de efluxo da suspensão de células durante a injeção e pelo aparecimento intactas da medula espinhal após o procedimento. Para este fim, é vital ter uma iluminação brilhante e direta na coluna do rato durante a laminectomia e durante a injeção. A iluminação ideal é facilitada pela iluminação de fibra óptica (Figura 2A). Figura 1 – Laminectomia (A) Uma vez vértebra T9 está solidamente realizada com a pinça Graefe, (B, C) ​​pontuação da coluna vertebral com bisturi entre T10 e T11 para facilitar a entrada da tesoura micro.. (D) Deslize cuidadosamente a tesoura micro através do espaço entre T10 e T11 (setas e inset, E) e cortar os pedículos de cada lado (traços, E) para libertar a lâmina dorsal. (F) Virar a lâmina até rostralmente e cortá-lo. Figura 2. Injeção de NSCs. (A) A configuração geral do micromanipulador com o hemostat segurando o mouse conectado ao braço esquerdo e na seringa Hamilton no braço direito em um ângulo de 70. (B) O hemostat segurar o spinalis dorsi conectando os espinhos de T8 e T9. (C) A agulha é reduzido através de tele linha média e na matéria cinzenta no hemisfério oposto, proximal ao canal central. Figura 3. Suturas e fechamento da ferida. (A) Suturas são aplicados à fáscia superficial em ambos os lados da incisão. (B) A incisão é fechada com grampos 03/02, conforme necessário (um grampo mostrado em uma ferida que necessitam 3).