Rilevazione di placche neuritiche nel modello di malattia di Alzheimer mouse

1. Fissazione dei cervelli del mouse e criosezionamento Topi transgenici sono sacrificati con anidride carbonica, seguita dalla decapitazione e il cervello estratto. Il cervello è sezionato longitudinalmente al centro. La metà del cervello saranno istantaneamente congelati in ghiaccio secco per l'analisi biochimica. L'altro sarà sommersa nel 4% paraformaldeide (PFA) per almeno 48 ore a 4 ° C. Dopo la fissazione in PFA 4% per almeno 48 ore, il cervello emi sono trasferiti direttamente nella soluzione di saccarosio al 30% e posto a 4 ° C. Al punto, il cervello dovrebbe essere emi galleggiante nella soluzione di saccarosio. Quando il cervello Hemi affondò sul fondo, di solito richiede circa 48 ore, è pronto per essere incorporato in ottobre per criosezionamento. Prima criosezionamento, montare un sottile strato di ottobre sulla manopola e far congelare a -20 ° C. Rimuovere il cervelletto dal resto del cervello e emi posto sullo strato di gelato ottobre Coprire immediatamente il cervello emi con OCT e permettono di congelare lentamente a -20 ° C. Una volta che l'embedding ottobre il cervello si è trasformato opaco, è pronto per essere sezionato. Impostare lo spessore di ogni sezione a 30 micron. Raccogliere ogni fetta in un contenitore con la soluzione D'Olomos. 2. Procedura di immunoistochimica per placche neuritiche (gratuito sezioni flottante) Trattare ogni sezione in 88% di acido formico per 15 minuti. Dopo il trattamento con acido formico, la sezione sarà temporaneamente volta opaco e può apparire avvizzire. Rimuovere ogni sezione in un piatto e lavare con Tx-PBS (0,3% Triton X-100 in PBS) per 5 min x 3 agitando delicatamente. Perossido di blocco endogeno blocco dello 0,5% H 2 O 2 in Tx-PBS, RT 30 minuti agitando delicatamente. Lavare con Tx-PBS per 10 min x 3 agitando delicatamente. Sezione di blocco con 5% senza grassi del latte scremato sciolto in Tx-PBS a temperatura ambiente per 1 ora agitando delicatamente. Incubare le sezioni in anticorpo primario (biotinilato 4g8, 1:500-1:2000, Sigillo) diluito in Tx-PBS contenente 5% del latte a 4 ° C per una notte agitando delicatamente. Lavare con Tx-PBS per 10 min x 3 agitando delicatamente. Preparare protocollo del produttore soluzione ABC successivo (Elite ABC, Vector Laboratories). Incubare le sezioni in miscela ABC per 30 minuti agitando delicatamente. Lavare con Tx-PBS per 10 min x 3 agitando delicatamente. Preparare 3,3 '-diaminobenzidina tetraidrocloruro (DAB) (Vector Laboratories) protocollo del produttore successivo. Incubare le sezioni in miscela DAB per 5-10 min. A questo punto, si potrà osservare un colore brunastro svilupparsi su ogni sezione. Lavare con Tx-PBS per 10 min x 3 agitando delicatamente. Free-floating sezioni cervello sono montate su vetrini rivestiti di gelatina, per aiutare con l'adesione dei tessuti. Le sezioni sono poi essiccate all'aria seguita da compensazione con una serie di xilene e montati in Entellen. Placche sono visualizzati al microscopio ottico con ingrandimento 40X e sono quantificati valutando la media della conta targa per fetta per ogni mouse. 3. Thioflavin S colorazione procedura per l'individuazione delle placche neuritiche Sacrificio del mouse e procedure di estrazione del cervello sono quelli indicati in punti da 1.1 a 1.5. Montare 4-5 sezioni del cervello emi su un vetrino e lasciare asciugare completamente prima della colorazione. Lavare i vetrini con etanolo al 70% per 1 minuto. Lavare i vetrini con 80% etanolo per 1 minuto. Incubare i vetrini in soluzione filtrata (0,2 micron filtro) thioflavin S (1% a 80% di etanolo) per 15 minuti. (Soluzione Thioflavin S deve essere filtrata prima di ogni utilizzo). Nota: thioflavin S proteggere dalla luce e proteggere i vetrini colorati dalla luce. Lavare i vetrini con 80% etanolo per 1 minuto. Lavare i vetrini con il 70% etanolo 1 minuto. Lavare con acqua distillata due volte. Diapositive montare in acquosi di montaggio e permettere che i vetrini ad asciugare al buio per almeno 2 ore, seguita da coprioggetto tenuta con smalto trasparente. Sezioni colorate devono essere conservati al buio a 4 ° C. La fluorescenza verde placche colorate possono essere visualizzate con microscropy fluorescenti. Analizzare le diapositive entro una settimana, perché la colorazione svanirà con il tempo. 4. Rappresentante Risultati Nel nostro recente studio sulla efficacia del farmaco anti-epilettico e stabilizzatore dell'umore acido valproico (VPA) per inibire la formazione di placche neuritiche, abbiamo usato il immunocolorazione sopra descritto e thioflavin S colorazione procedure per identificare le placche neuritiche nei topi modello dC (3). La figura 1 rappresenta un tipico 9 mesi APP23 topo transgenico, colorate con 4g8 con anti-Aβ biotinilato e rilevati con il metodo ABC. Placche neuritiche sono chiaramente etichettati con l'anticorpo e sono indicati dalle frecce bianche. Mediante colorazione thioflavin S, abbiamo rilevato deposizione neuritiche targa 2 mesi vecchia APP23xPS traditopi nsgenic (Figura 2). Thioflavin S legato Aβ contenenti placche neuritiche appare verde al microscopio a fluorescenza (indicato da frecce bianche). Abbiamo dimostrato che il trattamento con VPA, la formazione di placche neuritiche è significativamente ridotto (3). In un altro studio, abbiamo studiato l'ipossia molecolare collegamento sottostante e patogenesi dell'Alzheimer. Ancora una volta, utilizzando sia 4g8 anti-Aβ colorazione immunoistochimica e colorazione thioflavin S, abbiamo scoperto che l'ipossia favorito la formazione di placche contenenti Aβ neuritiche (4). Figura 1. Analisi immunoistochimica della formazione di placche neuritiche in topi transgenici dC. APP23 topi all'età di 9 mesi sono stati sacrificati e sono stati sezionati, fissa e sezionato. Placche neuritiche nel dell'ippocampo sono state rilevate con un anti-Aβ 4g8 anticorpo e sono stati sviluppati utilizzando i metodi ABC e DAB. Le placche sono state visualizzate mediante microscopia ottica con 40X. Frecce bianche indicano placche neuritiche Aβ. Figura 2. Colorazione Thioflavin S di placche neuritiche nei topi dC modellato. APP23xPS45 doppio topi transgenici a 8 settimane di vita sono stati sacrificati e sono stati sezionati, fissa e sezionato. Piaghe neuritiche nel dell'ippocampo sono state confermate mediante colorazione fluorescente thioflavin S e visualizzati al microscopio con ingrandimento 40x. Frecce bianche indicano thioflavin S placche neuritiche macchiato.