Axonal 상해 다음 도설 루트 신경 조직에서 염색질의 Immunoprecipitation
Summary
우리는 axonal 부상 다음 지느러미 루트 신경 조직에서 염색질 immunoprecipitation을위한 방법을 제시한다. 접근 방식은 특정 전사 인자 바인딩 사이트와 주변 및 중추 신경계 모두에서 부상을 axons의 재생을위한 히스톤 및 DNA의 중요한 epigenetic 수정을 식별하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
주변 신경계 (PNS)에 그가 부상 후 제한된 범위 (탱 외., 2006)으로 재생을하는 동안 중추 신경계 (CNS)에 Axons이 재생되지 않습니다. 이것은 neurite 및 axonal 가지 필수 transcriptional 프로그램 PNS (Makwana 외., 2005)의 부상에 따라 활성화되는 인식됩니다. 그러나 생체내로의 연결을 유전자 규제를 분석에 사용할 수있는 도구가 제한되어 종종 도전하고 있습니다.
CNS와 PNS 모두 같은 소마에서 발생하는 bifurcated 축삭에 의해 innervated 때문에 지느러미 루트 신경 (DRG)는 훌륭한 상해 모델 시스템을 제공합니다. 신경은 모든 transcriptional 이벤트가 발생 세포 기관의 이산 컬렉션을 대표하고, 따라서 쉽게 reproducibly 동물에서 제거할 수 있습니다 transcriptional 활동의 명확하게 정의된 영역을 제공합니다. axonal 중생이 발생 PNS (예 : 좌골 신경)에서 신경 섬유의 부상은 재생이 장소 (예 : 척수을하지 않습니다 어디 CNS에서 비슷한 부상에 대응 사람에서 구분되는 transcriptional 프로그램의 집합을 공개합니다 ). 히스톤, 바인딩 전사 인자와 부상에서 PNS 또는 CNS 중 하나에 발생 DNA 조작을위한 사이트는 염색질 immunoprecipitation을 (칩)을 사용하여 특징하실 수 있습니다.
여기, 우리는 axonal 부상을 다음과 고정 마우스 DRG 조직을 사용하여 칩 프로토콜을 설명합니다. 이 강력한 결합은 axonal 재생을 촉진하는 데 필요한 프로 재생 염색질 환경을 특성화를위한 수단을 제공합니다.
Protocol
Discussion
이 프로토콜은 직접 axonal 부상 다음과 같은 성인 신경계의 axonal 중생 중에 염색질 환경에 대해 문의하는 방법을 제공합니다. 그것은 PNS 또는 CNS를 하나에 부상 이후 transcriptional 및 epigenetic 환경을 탐사하기 위해 염색질 immunoprecipitation와 DRG 상해 모델을 포함합니다. 그것은 자신이 좋아하는 전사 인자에 대한 putative 구속력이 사이트를 특성화하고 싶습니다,이 사이트의 수용 인원은 부상에 대한 응…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 미세 조정 칩에 대한 조건에 자신의 기여에 대한 실험과 리코 린드너의 초기 칩 실험 설정에 대한 도움 안드레아 테데스키 감사하고 싶습니다. 이 작품은 Hertie 재단에 의해 지원되었다; 포춘 그랜트, Tuebingen 대학 및 DFG DI 1497/1-1 보조금 (모든 시몬 디 지오 바니 부여).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
Referencias
- Beirowski, B. Quantitative and qualitative analysis of Wallerian degeneration using restricted axonal labelling in YFP-H mice. Journal of Neuroscience Methods. 134, 23-35 (2004).
- Carey, M. F. . Chromatin immunoprecipitation (ChIP). , (2009).
- Dahl, J. A. A rapid micro chromatin immunoprecipitation assay (μChIP. Nat. Protoc. 3, 1032-1045 (2008).
- Haring, M. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 11, 3-11 (2007).
- Jiang, Y. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neurosci. 9, 42-42 (2008).
- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
