軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からのクロマチン免疫沈降
Summary
我々は、軸索損傷後の脊髄後根神経節の組織からクロマチン免疫沈降法を提示する。アプローチは、特定の転写因子結合部位と末梢および中枢神経系の両方で負傷した軸索の再生のための重要なヒストンとDNAのエピジェネティックな修飾を識別するために使用することができます。
Abstract
中枢神経系における軸索（CNS）、末梢神経系（PNS）のものは、損傷後の限られた範囲内で再生成しない状態が再生しない（総統ら 、2006）。それは、神経突起と軸索伸長に必須の転写プログラムはPNSの損傷（Makwana ら 、2005）により再活性化されていることが認識されている。しかし、in vivoでの神経細胞の遺伝子調節を分析するために利用できるツールは限られており、頻繁に挑戦です。
CNSとPNSの両方が同一の細胞体から発信された二股の軸索によって支配されているため、後根神経節（DRG）は、優秀な傷害のモデルシステムを提供しています。ガングリオンは、すべての転写のイベントが発生する細胞体の離散集合を表すため、容易にかつ再現性の動物から除去することができる転写活性の明確に定義された領域を提供します。軸索再生が発生しないPNS（例えば坐骨神経）、神経線維の損傷、再生が（例えば、脊髄を行われていないCNSにおける同様の傷害に応答するものとは異なる転写一連のプログラムを、明らかにすべき）。ヒストン、結合転写因子とPNSやCNSのいずれかに傷害に起因するDNA修飾のためのサイトは、クロマチン免疫沈降（チップ）を使用して特徴づけることができる。
ここでは、軸索損傷後の固定マウスのDRGの組織を使ってチッププロトコルについて説明します。この強力な組み合わせにより、軸索再生を促進するために必要なプロ再生クロマチン環境を特徴づけるための手段を提供します。
Protocol
Discussion
このプロトコルは、直接軸索損傷後の成人の神経系における軸索再生中にクロマチン環境について質問する方法を提供する。それはPNSやCNSのいずれかに傷害に続く転写とエピジェネティックな環境を調べるためにクロマチン免疫沈降法でDRG傷害モデルを搭載しています。それは自分の好きな転写因子のための推定結合部位を特徴づけるために、これらのサイトの占有率は傷害に反応して発生?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は微調整ChIPの条件への貢献のために研究室とリコリンドナーで最初のChIP実験のセットアップについて詳しくはアンドレアテデスキに感謝します。この作品は、Hertie財団によってサポートされていました。フォーチュングラント、チュービンゲン大学、およびDFG DI 1497/1-1の助成金を（すべてのシモーネディジョバンニに付与される）。
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
Referencias
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