Chromatin Immunopräzipitation aus Spinalganglien Tissue folgende axonale Schädigung
Summary
Wir stellen eine Methode zur Chromatinimmunpräzipitation aus Spinalganglien Gewebe nach axonalen Verletzungen. Der Ansatz kann verwendet werden, um spezifische Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und epigenetische Modifikation von Histon-und DNA wichtig für die Regeneration von verletzten Axonen sowohl in den peripheren und zentralen Nervensystems zu identifizieren.
Abstract
Axone im zentralen Nervensystem (ZNS) nicht regenerieren, während die in das periphere Nervensystem (PNS) regenerieren zu tun, um in begrenztem Umfang nach einer Verletzung (Teng et al., 2006). Es wird anerkannt, dass transkriptionelle Programme unerlässlich für Neuriten und axonale Auswachsen nach Verletzungen im PNS (Makwana et al., 2005) reaktiviert werden. Doch die Werkzeuge zur Verfügung, um neuronale Genregulation in vivo zu analysieren sind begrenzt und oft eine Herausforderung.
Die Spinalganglien (DRG) bieten eine hervorragende Verletzungen Modellsystem, weil beide das ZNS und PNS durch eine gegabelte Axon, die aus dem gleichen soma innerviert. Die Ganglien stellen eine diskrete Ansammlung von Zellkörpern, wo alle transkriptionelle Ereignisse auftreten, und somit eine klar definierte Region transkriptionelle Aktivität, die sich leicht und reproduzierbar aus dem Tier entfernt werden kann. Verletzung von Nervenfasern im PNS (zB Ischiasnerv), wo axonale Regeneration auftritt, sollte man ein Set von Transkriptions-Programme, die sich von denen der Reaktion auf eine ähnliche Verletzung im ZNS, in denen eine Regeneration nicht stattfindet (z. B. Rückenmark ). Websites für Transkriptionsfaktorbindungsstellen, Histon-und DNA-Modifikation aus der Verletzung entweder PNS oder ZNS charakterisiert Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) werden.
Hier beschreiben wir eine ChIP-Protokoll mit festen Maus DRG Gewebe nach axonalen Verletzungen. Diese leistungsstarke Kombination bietet ein Mittel zur Charakterisierung der pro-Regeneration Chromatin Umfeld für die Förderung der axonalen Regeneration.
Protocol
Discussion
Dieses Protokoll bietet eine Methode, um direkt über die Chromatin-Umgebung stellen während der axonalen Regeneration im adulten Nervensystem folgende axonale Schädigung. Es enthält die DRG Verletzungen Modell mit Chromatin-Immunopräzipitation der Transkriptions-und epigenetische Umgebung im Anschluss an eine Verletzung des PNS oder ZNS entweder Sonde. Es ist besonders nützlich für die Ermittler, die gerne putative Bindungsstellen für ihre Lieblings-Transkriptionsfaktor zu charakterisieren, und würde, um festzu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Andrea Tedeschi für Hilfe bei der Einstellung der anfänglichen Chip-Experimente im Labor und Ricco Lindner für seinen Beitrag zur Feinabstimmung der Bedingungen für ChIP. Diese Arbeit wurde von der Hertie-Stiftung unterstützt, die Fortune-Grant, Universität Tübingen und der DFG DI 1497/1-1 Zuschüsse (alle Simone Di Giovanni gewährt).
Materials
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| 10x ChIP Buffer | Cell Signaling | 7008 |
| 2x ChIP Elution Buffer | Cell Signaling | 7009 |
| ChIP Grade Protein G Magnetic Beads | Cell Signaling | 9006 |
| Magna Grip Rack (8 well) | Millipore | 20-400 |
| Chloroform | MERCK | UN 1888 |
| 37% Formaldehyde | ROTH | CP10.1 |
| 10x Glycine Solution | Cell Signaling | 7005 |
| Glycogen | Sigma | G1767 |
| 10x HBSS | Gibco | 14185 |
| Histone H3 antibody (rabbit) | Cell Signaling | 2650 |
| Normal Rabbit IgG | Cell Signaling | 2729 |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol | ROTH | A156.1 |
| Protease Inhibitors Cocktail Tablets | Roche | 04 693 116 001 |
| Proteinase K (20 mg/ml) | Cell Signaling | 10012 |
| SDS Lysis Buffer | Upstate | 20-163 |
| Equipment needed |
|---|
| Sonicator |
| Micropestle |
| Microcentrifuge |
| Thermomixer |
Referencias
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- Lee, A. Isolation of neural stem cells from the postnatal cerebellum. Nat Neurosci. 8, 723-729 (2005).
- Makwana, . Molecular mechanisms in successful peripheral regeneration. Febs J. 272, 2628-2638 (2005).
- Tedeschi, A. A p53-CBP/p300 transcription module is required for GAP-43 expression, axon outgrowth, and regeneration. Cell Death and Differentiation. 16, 543-554 (2009).
- Teng, F. Y. Axonal regeneration in adult CNS neurons–signaling molecules and pathways. J Neurochem. 96, 1501-1508 (2006).
