Экстракции ДНК из парафин материала для генетических и эпигенетических Анализы
Summary
Это видео демонстрирует протокол для выделения ДНК из фиксированных формалином парафин материала. Это многодневных процедура, при которой ткань разделы deparaffinized с ксилол, регидратации с этанолом и обрабатывают протеиназы К, чтобы очистить и изолировать ДНК для последующего гена или конкретной генома анализа.
Abstract
Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20°C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.
Protocol
Discussion
Биопсии или хирургическим путем вырезали ткани для гистологического анализа и диагностики часто фиксированных формалином и залитые парафином (FFPE) для длительного хранения. С ростом интереса к пониманию генетической основы болезни, умение извлекать ДНК из этих образцов представляет бесценный источник диагностического материала, который может быть использован для геномного анализа и поступательное исследований. Исторически FFPE образцы не считается жизнеспособным источником для молекулярного анализа, как нуклеиновые кислоты могут быть сильно изменены белково-нуклеиновых и белок-белковые сшивки 6. Тем не менее, открытие, что протеазы пищеварения релизы фрагментирован нуклеиновых кислот, которые подходят для последующих анализов, включая ПЦР, массив CGH, последовательность и метилирования профилирование, позволяет использовать эти ценные образцы для генетического анализа 6.
Экстракции ДНК из парафиновых срезах тканей является надежной процедурой, которая опирается на дифференциальные растворимости для очистки ДНК. Извлеченные качества ДНК и количество и успех последующей амплификации ДНК зависит от ряда параметров до, во время и после экстракции. Они включают, но не ограничиваются: тип и количество ткани, тип фиксатора используется для сохранения ткани, длительность фиксации, возраст блок парафина и условий хранения, а также длину желаемого сегмента ДНК, чтобы быть усиливается 1,7. Удаление парафина из тканей является наиболее важным шагом для успешного извлечения как нерастворенных парафина приводит к ухудшению качества образца и ингибирование ПЦР.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Лам для их оценки и критика этого видео и статьи. Работа выполнена при поддержке за счет средств канадского института исследований в области здравоохранения.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
Referencias
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
