הפקת DNA מחומר פרפין Embedded עבור ניתוח גנטי epigenetic
Summary
וידאו זה מדגים את פרוטוקול להפקת דנ"א החומר פורמלין קבוע, פרפין, מוטבע. זהו הליך רב היום שבו חלקים רקמה deparaffinized עם קסילן, rehydrated עם אתנול שטופלו proteinase K לטהר לבודד DNA לצורך ניתוח גנטי ספציפי או הגנום כולו שלאחר מכן.
Abstract
התפתחות מחלות התקדמות מאופיינים סטיות גנטיות epigenetic תכופים כולל rearrangements כרומוזומליות, מספר רווחי העתק הפסדים מתילציה בדנ"א. ההתקדמות תפוקה גבוהה, הגנום כולו טכנולוגיות אפיון, כגון microarrays, שיפרו באופן משמעותי את היכולת שלנו לזהות לזהות אלו שינויים ספציפיים. אולם ככל שהטכנולוגיה ממשיכה להשתפר, גורם מגביל נשאר איכות המדגם זמינות. מידע קליני יתר על כן, מעקב והתוצאה מחלה נאספים לעתים קרובות שנים לאחר איסוף הדגימה הראשונית. דוגמאות, בדרך כלל, פורמלין קבוע פרפין מוטבע (FFPE), נשמרים בארכיון בית החולים במשך שנים עשורים. ה-DNA ניתן לשחזר ביעילות פרפין מ-מוטבע דגימות אם בשיטה המתאימה ממוצא מוחל. ה-DNA באיכות גבוהה המופק דגימות נשמר כראוי מאוחסנים יכול לתמוך מבחני כמותי להשוואות של רקמות בריאים וחולים, דור של חתימות גנטיות epigenetic 1. כדי לחלץ דנ"א פרפין, מוטבע דגימות, גרעינים רקמה או רקמות microdissected כפופים טיפול קסילן, אשר ממיס את פרפין מן הרקמה, ואת rehydrated מכן באמצעות סדרה של שוטף אתנול. חלבונים ואנזימים מזיקים כגון nucleases מתעכלים לאחר מכן על ידי proteinase ק תוספת של חיץ תמוגה, אשר מכיל חומרים denaturing כגון נתרן גופרתי dodecyl (SDS), מקלה על העיכול 2. חומצות גרעין הן מטוהרים מן lysate את הרקמה באמצעות חיץ רווי צנטריפוגה מהירות פנול גבוהה אשר מייצר פתרון biphasic. DNA ו-RNA נשארים בשלב מימית העליון, בעוד חלבונים, שומנים סוכרים הם מוחרם בין ואורגניים שלבי בהתאמה. שמירה של השלב מימיות עקירות פנול חזר יוצר מדגם נקי. בעקבות עקירות פנול, RNase מתווסף לחסל רנ"א מזהם. פנול עקירות נוספות הבאים הדגירה עם RNase משמשים כדי להסיר כל אנזים הנותרים. תוספת של נתרן אצטט ו-DNA isopropanol משקעים, ו צנטריפוגה במהירות גבוהה משמש גלולה את ה-DNA ולאפשר הסרת isopropanol. עודף מלחים שמקורם משקעים יכול להפריע מבחני האנזימטית שלאחר מכן, אבל ניתן להסיר את ה-DNA על ידי שטיפה עם אתנול 70%, ואחריו צנטריפוגה מחדש גלולה את ה-DNA 3. DNA הוא מחדש המרחפים במים מזוקקים או החיץ של בחירה, לכמת ומאוחסנים ב -20 ° C. ה-DNA מטוהרים יכול לאחר מכן לשמש ביישומים במורד הזרם אשר כוללים, אך לא מוגבלים, PCR, גנומית השוואתי מערך הכלאה 4 (מערך CGH), immunoprecipitation DNA מפוגל (MeDIP) וסדר, המאפשר ניתוח אינטגרטיבי של דגימות רקמה / גידול.
Protocol
Discussion
רקמות או ביופסיה נכרת בניתוח לניתוח אבחון היסטופתולוגיות ולעתים קרובות קבוע בפורמלין מוטבע פרפין (FFPE) עבור אחסון לטווח ארוך. עם העניין הגובר בהבנת הבסיס הגנטי של המחלה, היכולת להפיק דנ"א מדגימות אלה מהווה מקור רב ערך של חומר אבחון שיכולות לשמש לניתוח גנומי מחקרים translational. היסטורית דגימות FFPE לא נחשבו למקור קיימא עבור ניתוח מולקולרי כמו חומצות גרעין עשוי להיות שונה במידה רבה על ידי חומצה חלבון גרעין חלבונים לחצות קישור 6. עם זאת, הגילוי כי מערכת העיכול פרוטאז משחרר חומצות גרעין מקוטע אשר מתאימים מנתח במורד הזרם כולל PCR, מערך CGH, רצף פרופיל המתילציה, מאפשר שימוש בדגימות אלה חשובים לניתוח גנטי 6.
מיצוי דנ"א פרפין, מוטבע רקמות היא הליך חזקים המסתמכת על מסיסות ההפרש לטהר את ה-DNA. DNA חולץ איכות וכמות ואת ההצלחה של הגברה DNA הבאים תלויה במספר פרמטרים לפני, במהלך ואחרי החילוץ. אלה כוללים, אך אינם מוגבלים ל: סוג וכמות הרקמה, סוג של מקבע משמש לשימור רקמות, משך קיבעון, גיל של גוש פרפין תנאי האחסון, כמו גם את אורכו של קטע ה-DNA הרצוי להיות מוגבר 1,7. הסרת פרפין מרקמות הוא השלב הקריטי ביותר להפקת מוצלח כמו פרפין שלא נמס מוביל באיכות דגימה עניים עיכוב הגברה PCR.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחברי במעבדה לאם להערכה שלהם ומבקר של וידאו זה מאמר. עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מן המכונים הקנדי לחקר בריאות.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
Referencias
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
