Ex Vivo Kültür İlköğretim İnsan Fallop Tüp Epitel Hücreleri

1. Kollajen hazırlanması ve Filtre Kaplama. Human plasental kollajen hazırlamak için 30 mg, human plasental kollajen Tweeze ve heyecan bar ile 500 ml beher 50 ml distile su (dH 2 O) üst üste koymak. Daha kolay çözülür hale getirmek için doğrudan kollajen üzerine 100 μls buzul asetik asit ekleyin. Sıcak – 37 ° C ve kollajen erimesi için karıştırın. 20-30 dakika içinde çözülür. Kolajen iplikçikleri çözüm kalırsa, filtre sterilizasyonu zor olacaktır. DH 2 O ve 0,2 mikron membran filtre ile sterilize 450 ml, 50 ml stok sulandırınız. Bu son çalışma çözümdür. 4 ° C saklayınız Transwell filtre membranlar kolajen (50-100 ul) gece boyu kaplama onları hazırlayın. Soğuk kollajen RT ısındı ve daha sonra bir gecede ve RT membran kapsayacak şekilde üst bölmesi eklenmesi gerekir. Ayrışmış primer fallop tüpü (FT) epitel (aşağıya bakın) transwell filtreleri üzerine kaplama önce üç kez 1X fosfat Aşırı kollajen kaldırmak için kullanmadan önce tuzlu su (PBS) en az 1 saat tamponlu filtreler yıkayın. 2. Doku Toplama ve Ayrılma. Taze fallop tüpü (FT) fimbria 50 ml santrifüj tüpüne steril 1X PBS içinde toplanır ve steril doku kültürü kaputu işleme istemi için önce buz üzerinde tutulmalıdır olmalıdır. (Örnek toplanan veya başka bir medya türü en azından mümkün olduğu kadar çok kan ve yabancı medya olarak bu kaplama verimliliği ile etkileşebilir kurtulmak için 3X kanlı yıkama varsa) bir kez 20 ml soğutulmuş 1X PBS doku örneği yıkayın. Steril neşter ve steril bir cımbız kullanarak, küçük bir PBS ve 10 cm doku kültürü çanak, steril bir cımbız transferi FT kullanarak, epitel hücrelerinin maruz kalma en üst düzeye çıkarmak için uzunlamasına kesilir. Artık bir tüp değil, neredeyse düz bir levha doku böylece fimbria açın. Sonra daha küçük ama daha hala geri adet (yaklaşık 3 mm çapında) oyulmuş. 45 ml (1.4 mg / ml Pronase ve 0.1 mg / ml DNAz içeren MEM) 50 ml'lik bir tüp içinde soğutulmuş disosiasyon medya adet aktarın. 4 ° C 24 ila 72 saat için hafifçe sallayın. (48 saat deneyimlerinden, en uygunudur). Bir slaytta disosiasyon medya bir damla koymak, disosiasyon miktarını kontrol edin ve topaklanma ve doku canlılığı (tüycüklü hücreleri yenerek) miktarını kontrol etmek için. Tek hücreler ve bazı küçük öbekler hem de görmek istiyorum. 3. Fallop Tüp Kaplama. Epitel hücre ayrılma miktarı optimum olduğunda, FBS% 10 hacmi ekleyerek medya inaktive. Küçük agrega içine hücre süspansiyonu çıkarmak için birkaç kez ters çevirin. Büyük doku kümeleri (stromal doku) alt tüp yerleşmek için izin verin. İkinci bir 50 ml'lik tüp içine epitel hücreleri içeren ortamları çıkarın. Orijinal 50 ml tüp 50 ml soğuk MEM (FBS) ekleyin. Ek hücreleri toplamak için ters çevirin. Üçüncü bir 50 ml tüp (örnek çok büyük ve yüksek hücre sayısı beklenen ise, bu adımı hücre toplama maksimize etmek için tekrar edilebilir) içine medya toplayın. Stromal / ekstraselüler doku büyük parça şimdi iptal edilebilir. Artık iki hücre süspansiyonu 50 ml tüpler var. Hücre pelletleri 5 dakika aspirat disosiasyon medya için 1000 rpm'de santrifüjleyin. 37 ° C'ye kadar ısındı USG medya (DMEM:% 2 USG ve% 1 Kalem Strep ile desteklenmiş F12) yaklaşık 5-10 ml içinde süspanse edin Yavaşça Pipet. Bu epitel hücrelerinde hasar ve kültürlerin kalitesini azaltabilir gibi çok güçlü bir şekilde pipetle için dikkatli olun. Tek hücre ve küçük öbekler (Şekil 1) olmalıdır. En az 1 saat veya 3 saat kadar primaria kültür yemekleri ve inkübe üzerine aktarın. Fibroblastlar ve kırmızı kan hücreleri, plastik sopa ama FT epitel hücreleri olmaz. Plakasına şey yapışmasını olup olmadığını görmek için bir saat sonra bir göz atın. Siliyalı hücrelerinin varlığı kirpikler dayak belirterek tarafından görülebilir. Bu İnkübasyon sırasında, kollajen kaplı filtreler (adım 1.4 'e bakınız) yıkanmış ve hücre kaplama için hazır. Primaria plakaları inkübasyon süresi 1-3 saat sonra, 15 ml tüp hücre süspansiyonu transferi ve durulama 5 ml USG medya ile primaria plaka, 15 ml nihai hacmi oluşturmak için bu medya tüp transferi. 1000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Dikkatlice aspire medya ve hücre pelletini bozmamak. Pelet boyutu tarafından bakılırsa, USG medya uygun miktarda tekrar süspansiyon haline getirin. Eğer gerekiyorsa daha sulandırmak böylece (Genellikle 1-3 ml arasında) Eksi başında daha iyidir. Yavaşça tekrar Bir hemasitometre 10 ul yeniden süspanse hücre ve hücre yoğunluğu belirlemek. İpuçları: belirgin bir karanlık hücre zarı ve non-kolumnar epitel hücreleri arıyoruz. Ayrıca kesinlikle hareket tüycüklü hücreleri saymak. Halo appearan daha küçük hücrelerce, kırmızı kan hücreleri ve sayılmamalıdır. Orada bazı topaklanma, böylece hücre sayısı tahmin etmek gerekir. Tohumlama hedef 1,65 x10 5 hücre / membran, ya da en azından% 75 oranında filtre kapsama alanı (Şekil 1 ). Hücreleri çok seyrek kaplama varsa, hücreler tam bir epitel tabakası oluşturmak mümkün olmayacaktır. USG medya ul 500 24 plaka iyi alt ve transwell eklemek. FT hücre süspansiyonu (yukarıya bakınız) gerekli olan hacim sonra her membran üzerine eklenebilir, bu genellikle 100 ul. Inkübasyon ve membran rahatsız üst olmadan 1-2 gün büyümeye. Gerekirse bu gün boyunca bazal tarafında medya değiştirebilirsiniz. 1-2 gün sonra, USG medya ile üst dikkatlice yıkayın ve medya membran üstüne küçük bir miktar (50-100 ul). Bu medya, mikroskobu önce filtreler apikal tarafında kaldırılırsa, hücre kültürlerinin birleştiği belirlemek için daha kolaydır. Alt bölmesi, her zaman medya içermelidir. Bir kez kültürler tam konfluent (normalde 5 gün içinde), apikal taraf için bazal filtreler aracılığıyla yolculuk medya miktarı ihmal edilebilir olmalıdır. Ilk 10 gün boyunca her iki günde bir kez bazal medya değiştirin. Alt bölmesi, her zaman hücrenin hayatta tutmak için medya sahip olması gerekir. Immünofloresan (IF) veya immünhistokimyasal (İHK) gibi daha ileri çalışmalar, kullanılabilir sıkı bir epitel tabakası (Şekil 1 ve 2) hücreleri oluşturdular. 4. Membran İşleme. Membran işlem yapılacaktır çalışmanın türüne bağlıdır, ancak genellikle transwell ekler filtre ayrılmasını gerektirir. Bu filtreler genellikle 1X PBS 200 ul çıkarmadan önce 3 kez yıkanır. Filtrelerin apikal ve bazal tarafındaki PBS aspire. Bu membranlar kurumasını önlemek için bir kerede 1 yapılmalıdır. Plaka eklemek çıkarın, ters çevirin ve membran etrafında kesmek için steril bir neşter kullanabilirsiniz. Tek parça membran yerine kenarında neşter sürükleyerek membran kenarı etrafında düz kesimler yaparak kaldırmayı deneyin. Parça hücrelerin hangi tarafta, tutarak, ekleme filtreyi kaldırmak için cımbız kullanın. Filtre, sonra uygun şekilde VARSA, İHK, vb işlenebilir. Örnek: çalışmaları, filtre (uygun antikorlar ile fiksasyon, permeabilization, engelleme ve inkübasyon sonra, standart prosedürler EĞER göre) bir slaytta yer olmalıdır EĞER DAPI, Vectashield UP karşı karşıya hücrelerin filtre üzerine bırakılır ve bir kapalı cam lamel. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Transwell filtreleri kolayca immünhistokimyasal (İHK) ve immünofloresan (IF), hem de ex vivo epiteli incelemek için silinebilir. Spesifik belirteçler soyundan kullanarak, bir resim ve sekretuar (Pax8 pozitif) ve siliyalı bu kültürlerin (Sall2 pozitif) hücre bölme (Şekil 3) ölçmek. Ayrıca, bu belirteçler kullanarak, her bir hücre tipi, 10 farklı fizyolojik ipuçları nasıl tepki vereceğini izleyebilirsiniz. Bu sistem, çeşitli uyaranlara yanıt olarak, FT epitelin secretome ve hücre içi phosphoproteome değişiklikleri karakterize etmek için kullanılmaktadır. Şekil 1. İllüstrasyon, birincil insan fallop tüpü dokusundan üretilen nasıl ex vivo kültürler resmeden Fallop tüpü fimbrial doku cerrahi seti elde edilen ve 24-72 saat 2 disosiasyon medya ile yıkanır ve inkübe küçük parçalar 1 oluşturmak için kıyılmış . Disosiasyon tamamlandıktan sonra, doku parçalarının 3 hasat kuluçka tüpün alt ve ayrışmış epitel hücreleri içeren medya yerleşmek için izin verilir. Disosiasyon, verimlilik, faz kontrast mikroskop 4 altında incelenmesi ile izlenebilir . Ayrışmış epitel hücreleri daha sonra primaria plakaları kültüre fibroblast ve değişmez epitel hücreleri 5 Karıştım hematopoetik hücreler kaldırmanıza yardımcı . Olmayan epitel hücreleri yeterince kaldırıldıktan sonra, epitel hücreleri transwell human plasental kollajen 5 ile kaplı filtreler üzerine numaralı seribaşı. Medya alttan transwell aracılığıyla difüzyon ile sağlanır. Kültürler 24-48 saat inkübe edilir ve daha sonra apikal medya kaldırılır. Ex vivo kültürleri sonra transwell filtreler oluşturmak için 5-8 gün için tam, tam çim büyümeye izin verilir. 4 hafta kadar ex vivo kültürleri bu durumda viably korunabilir. Karikatür 5 hemato ekleme ve vitray kaldırılır bir filtre bir örneği ile tam olarak yetiştirilen ex vivo kültür gösterirxylin ve eosin (H & E) ex vivo epitelin polarite ve mimari göstermek için. Şekil 2. FT ex vivo kültürlerin Parlak alan mikroskobu transwell ekler human plasental kollajen 0.4μm gözenekleri ile kaplı (a) görünür. FT epitel hücreleri (c) bir epitel tabakası oluşturan kollajen kaplı ekler (b), kültür. Bazı enkaz normalde tüycüklü hücreleri en sık epitel kültür hücreleri (oklarla gösterilen) bağlı kalarak görülmektedir. Şekil 3. FT ex vivo kültür immünofloresan (IF). Ex vivo kültürleri görüntülerini sabit ve (a) salgı (Pax8) karşı antikorlar ile boyandı ve (d) siliyalı hücre (Sall2) işaretleyicileri EĞER. DAPI hücre çekirdeğinin konumunu (mavi) (b) ve (e) ve birleştirilmiş antikor ve DAPI boyama da gösterilmiştir (c ve f) için bir kontrol olarak kullanılır. Sayıda hücre kültür hücreleri (Sall2 boyama, 3 gün Pax8 boyama, 7 gün) zaman uzunluğuna bağlıdır.