Culture ex vivo des cellules humaines primaires épithéliales des trompes de Fallope

1. Préparation de collagène et de revêtement du filtre. Pour préparer humaine collagène placentaire, tweeze à 30 mg de collagène placentaire humaine et de mettre sur le dessus de 50 ml d'eau distillée (dH 2 O) dans un bécher de 500 ml avec un barreau d'agitation. Ajouter 100 μls d'acide acétique glacial directement sur le collagène pour le rendre plus facile à dissoudre. Chaude à 37 ° C et remuer pour dissoudre le collagène. Il devrait se dissoudre dans les 20-30 minutes. Si brins de collagène restent en solution, la stérilisation du filtre sera difficile. Diluer le stock de 50 ml avec 450 ml de dH 2 O et filtre stériliser avec une membrane de 0,2 um. C'est la solution de travail final. Conserver à 4 ° C. Préparer membranes Transwell filtre en les enduisant de collagène (50-100 ul) pendant la nuit. Collagène réfrigérée doit être réchauffé à la température ambiante et ensuite ajouté à le compartiment supérieur pour couvrir la membrane pendant la nuit et à la température ambiante. Avant de plaquer les dissocier tube primaire de Fallope (FT) épithélium (voir ci-dessous) sur les filtres Transwell, se laver les filtres à trois reprises en phosphate de 1X saline tamponnée (PBS) au moins 1 heure avant de l'utiliser pour enlever l'excès de collagène. 2. Collection de tissus et de dissociation. Frais des trompes de Fallope (FT) fimbria doivent être collectés dans stérile PBS 1X dans un tube à centrifuger de 50 ml et conservés sur la glace avant le traitement rapide dans une hotte de culture de tissus stériles. Laver l'échantillon de tissu une fois dans 20 ml de PBS 1X froid (si l'échantillon a été recueilli dans un autre type de média ou laver les sanglantes moins 3X pour se débarrasser de beaucoup de sang et que les médias étrangers que possible, car cela pourrait interférer avec l'efficacité placage). En utilisant le transfert stériles FT pince à épiler pour un plat de 10 cm de culture de tissu avec un peu de PBS et, en utilisant une pince à épiler scalpel stérile et stérile, coupées longitudinalement pour maximiser l'exposition des cellules épithéliales. Ouvrez le fimbria afin qu'il ne soit plus un tube, mais une feuille presque à plat des tissus. Ensuite, couper en morceaux plus petits mais toujours récupérable (environ 3 mm de diamètre). Transfert des morceaux à 45 ml de la dissociation des médias réfrigérée (MEM contenant 1,4 mg / ml pronase et 0,1 mg / ml DNAse) dans un tube de 50 ml. Rocher doucement à 4 ° C pendant 24 à 72 heures. (À partir de l'expérience, de 48 heures est optimal). Pour vérifier la quantité de dissociation, mettre une goutte de dissociation des médias sur une lame et vérifiez le montant de l'agglutination et la viabilité des tissus (cellules ciliées battre). Vous voulez voir à la fois des cellules individuelles et quelques petites touffes. 3. Placage trompe de Fallope. Lorsque le montant de la dissociation des cellules épithéliales est optimale, inactiver les médias en ajoutant 10% du volume de FBS. Inverser à quelques reprises pour déloger les cellules en suspension dans de plus petits agrégats. Autoriser des touffes importantes de tissus (tissu stromal) de s'installer dans la partie inférieure du tube. Retirez les médias contenant des cellules épithéliales à un seconde Tube 50 ml. Ajouter 50 ml de MEM à froid (sans FBS) à l'original tube de 50 ml. Inverser pour recueillir des cellules supplémentaires. Recueillir des médias dans un troisième tube de 50 ml (si l'échantillon est très grand et un nombre élevé de cellules est prévu, cette étape peut être répétée afin de maximiser la collecte de cellules). Les grands morceaux de tissu stromal / extracellulaire peuvent désormais être mis au rebut. Vous avez maintenant deux tubes de 50 ml de suspension cellulaire. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 minutes et aspirer les médias dissociation de culots cellulaires. Remettre en suspension dans environ 5-10 ml de USG médias (DMEM: F12 supplémenté avec 2% USG et Pen 1% Strep) chauffé à 37 ° C. Pipette doucement. Attention à ne pas trop vigoureusement la pipette car cela peut endommager les cellules épithéliales et de réduire la qualité des cultures. Il devrait y avoir des cellules individuelles et de petits amas (figure 1). Transfert sur des boîtes de culture Primaria et incuber pendant un minimum de 1 heure ou jusqu'à 3 heures. Les fibroblastes et les globules rouges se coller au plastique, mais les cellules épithéliales FT ne sera pas. Jetez un oeil à la plaque après une heure pour voir si quelque chose est collé. La présence de cellules ciliées peuvent être vus en notant le battement des cils. Pendant cette incubation, les filtres revêtues de collagène peuvent être lavés et préparés pour le placage de cellules (voir étape 1.4) Après 1-3 heures d'incubation sur les plaques Primaria, le transfert de la suspension de cellules dans un tube de 15 ml et rincer la plaque Primaria avec 5 ml de milieu USG, le transfert de ce média dans le tube pour faire un volume final de 15 ml. Centrifuger à 1000 rpm pendant 5 minutes. Aspirer délicatement les médias et éviter de perturber le culot cellulaire. A en juger par la taille de granulés, remettre en suspension dans la quantité appropriée d'USG médias. (Généralement entre 1-3 ml) Moins est mieux dans le début de sorte que vous pouvez diluer davantage si vous avez besoin. Resuspendre délicatement. Ajouter 10 ul de cellules en suspension dans un hématimètre et de déterminer la densité cellulaire. Conseils: Vous recherchez des cellules épithéliales qui ont une membrane cellulaire distinctement sombres et sont non-cylindrique. Vous pouvez également compter les cellules ciliées qui sont certainement le déplacement. Les petites cellules qui ont une auréole appearanCE sont les globules rouges et ne doivent pas être comptés. Il y aura quelques grumeaux, vous avez donc besoin d'estimer que dans le nombre de cellules que vous. L'objectif de semis est de 1,65 x10 5 cellules / membrane, ou au moins 75% de couverture du filtre (figure 1). Si les cellules sont plaquées trop peu densément, les cellules ne sera pas en mesure de former une couche complète épithéliales. Ajouter 500 ul de la presse USG au fond du puits d'une plaque de 24 puits et insérez Transwell. Le volume nécessaire de suspension cellulaire FT (voir ci-dessus) peuvent ensuite être ajoutés sur chaque membrane, c'est typiquement 100 pi. Incuber et croître pendant 1-2 jours sans déranger dessus de la membrane. Vous pouvez modifier le support sur le côté basale pendant ces jours si nécessaire. Après 1-2 jours, vous pouvez rincer soigneusement le dessus avec USG médias et ajouter une petite quantité (50-100 ul) des médias sur le dessus de la membrane. Il est plus facile de déterminer la confluence des cultures de cellules si le support est enlevé de la partie apicale des filtres avant de microscopie. Le compartiment inférieur doit toujours contenir des médias. Une fois que les cultures sont totalement confluentes (normalement dans les 5 jours), le nombre de médias qui se déplace à travers les filtres de la base aux côtés apicale devrait être négligeable. Changer les médias basale fois tous les deux jours pour les 10 premiers jours. Le compartiment inférieur doit toujours avoir les médias pour garder les cellules vivantes. Une fois les cellules ont formé une couche serrée épithéliales (figures 1 et 2) ils peuvent être utilisés dans d'autres études, telles que l'immunofluorescence (IF) ou immunohistochimie (IHC). 4. Traitement membrane. De traitement membranaire est dépendant du type d'étude qui sera effectuée, mais implique généralement l'enlèvement du filtre des inserts Transwell. Les filtres sont généralement lavées 3 fois dans 200 ul de PBS 1X avant l'enlèvement. Aspirer PBS du côté apical et basal des filtres. Cela devrait être fait une bien à la fois pour éviter les membranes de sécher. Retirer l'insert de la plaque, retournez à l'envers et l'utilisation d'un scalpel stériles pour couper autour de la membrane. Essayez d'enlever la membrane en un seul morceau en faisant des coupes droites sur le bord de membrane, au lieu de glisser le scalpel sur le pourtour. Utilisez une pince à épiler pour enlever le filtre de l'insert, garder une trace de quel côté les cellules sont allumés. Le filtre peut ensuite être traitées pour IF, IHC, etc, le cas échéant. Exemple: pour si des études, le filtre (après fixation, perméabilisation, le blocage et l'incubation avec les anticorps appropriés, conformément à la norme SI procédures) doivent être placés sur une lame, les cellules vers le haut, Vectashield avec DAPI est tombé sur le filtre et recouvert d'une verre de la lamelle. 5. Les résultats représentatifs: Les filtres transwell peut être facilement enlevé pour examiner l'épithélium ex vivo par les deux immunohistochimie (IHC) et l'immunofluorescence (IF). En utilisant la lignée des marqueurs spécifiques, on peut d'image et de quantifier la sécrétion (PAX8 positif) et ciliées (Sall2 positif) des compartiments cellulaires dans ces cultures (figure 3). Par ailleurs, l'utilisation de ces marqueurs, on peut surveiller la façon dont chaque type de cellule répond à différents signaux physiologiques 10. Ce système a été utilisé pour caractériser les changements dans les phosphoprotéome sécrétome et intracellulaire de l'épithélium FT en réponse à divers stimuli. Figure 1. Illustration de la manière dont l'ex vivo cultures sont générées à partir des tissus primaires tube de Fallope humaines. Tissus trompe de Fallope fimbriae est obtenu à partir du bloc opératoire et émincé de générer de petits fragments 1 qui sont lavées et incubées avec la dissociation des médias pendant 24-72 heures 2. Après la dissociation est complète, les fragments de tissus sont autorisés à se déposer au fond du tube d'incubation et les médias contenant les cellules épithéliales dissociées est récolté 3. L'efficacité de la dissociation peuvent être surveillés par un examen au microscope de 4 à contraste de phase. Les cellules épithéliales dissociées sont ensuite cultivées sur des plaques Primaria pour aider à éliminer des fibroblastes et les cellules hématopoïétiques qui, invariablement, mélangés avec les cellules épithéliales 5. Une fois les cellules non épithéliales sont suffisamment retiré, les cellules épithéliales sont ensemencés sur des filtres transwell qui sont revêtus de collagène placentaire humaine 5. Les médias sont fournies par diffusion à travers la transwell d'en bas. Les cultures sont incubées pendant 24-48 heures, puis les médias apicale est enlevé. Les cultures ex vivo sont alors autorisés à croître pendant 5-8 jours pour former un plein complet sur ​​la pelouse filtres transwell. Les cultures ex vivo peut être maintenu dans cet état ​​viable pour un maximum de 4 semaines. La caricature 5 montre une représentation de la culture ex vivo entièrement développé avec un exemple d'un filtre retiré de l'insert et colorées avec hématoxylin et l'éosine (H & E) pour démontrer la polarité et de l'architecture de l'épithélium ex vivo. Figure 2. Microscopie à champ lumineux des cultures FT ex vivo. Inserts Transwell sont revêtues de placenta humain pores 0.4μm collagène sont visibles (a). Cellules épithéliales FT sont cultivés sur les inserts revêtues de collagène (b), où ils forment une couche épithéliale (c). Certains débris sont normalement observées adhérer aux cellules épithéliales de la culture (indiquées par des flèches), le plus souvent des cellules ciliées. Figure 3. FT ex vivo la culture immunofluorescence (IF). Exemples de SI images des cultures ex vivo fixées et colorées avec des anticorps contre (a) sécrétoire (PAX8) et (d) des cellules ciliées (Sall2) marqueurs. DAPI est utilisé comme un contrôle pour l'emplacement des noyaux cellulaires (bleu) (B et E) et l'anticorps fusionné et coloration DAPI est également indiqué (C et F). Le nombre de cellules dépend de la longueur de temps les cellules sont en culture (PAX8 coloration, 7 jours; Sall2 coloration, 3 jours).