셀을 별 모양으로 일곱 단계
Summary
여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 격리를 위해 방법을 설명합니다. 별 모양의 세포 정화 들어, 마우스 간은이 소화되게하여<em> 현장에서</em>과<em> 체외에서</em> 밀도 기울기 원심 분리하기 전에 pronase – collagenase 처리에 의해. 이 기술은 고도로 순수한 간장 별 모양의 세포를 산출.
Abstract
간장 별 모양의 세포 스타 같은 형태의 간 세포 거주하고 간 사인 내피 세포와 hepatocytes 1,2 사이에 쭉 내려 가래의 공간에 위치하고 있습니다. 별 모양의 세포는 골수 엽 성의 전구 물질에서 파생 및 토탈 바디 비타민 A 1, 2의 80 %를 저장할 수 있습니다. 활성화되면, 별 모양의 세포 따라서 간 섬유증 3 기여, 세포외 기질을 생산 myofibroblasts로 구분. 계약을 자신의 능력에 따라 myofibroblastic 별 모양의 세포가 포털 고혈압 4 연관된 혈관 음색을 조절할 수 있습니다. 최근, 우리는 간장 별 모양의 세포가 강력한 항원 제시 세포이며, NKT 세포뿐만 아니라, 기존의 T lymphocytes 5 활성화할 수 있습니다 보여주었다.
여기 마우스 간부터 간장 별 모양의 세포의 효율적인 준비 방법을 제시한다. 그들 perisinusoidal 현지화으로 인해, 간장 별 모양의 세포의 격리는 여러 단계로 이루어집니다. 쭉 내려 가래의 공간에서 고립에 액세스할 별 모양의 세포를 렌더링하기 위해서는 마우스 간은이 소화 효소 Pronase E와 Collagenase P. 다음과 재관류로 현장에 perfused 있으며, 간 조직은에 Pronase E와 Collagenase P와 함께 추가적인 효소 치료를 받게됩니다 체외. 이후, 방법은 간장 별 모양의 세포에 비타민 A – 저장 지질 방울의 엄청난 금액을 활용합니다. 이 기능은 8퍼센트 Nycodenz 기울기에 원심 분리하여 다른 간장 세포 유형에서 별 모양의 세포의 분리 수 있습니다. 프로토콜 여기에서 설명한은 별 모양의 세포의 매우 순수하고 동질적인 인구 산출. 준비 순도는 이전 형광 현미경이나 유동세포계측법에 의해 분석 마커 분자 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)에 대한 염색법에 의해 평가하실 수 있습니다. 또한, 가벼운 현미경은 지질 방울의 높은 금액을 가지고 있고, 별 모양의 간장 별 모양의 세포의 독특한 모양을 보여준다.
함께 찍은, 우리는 그들의 대표적인 형태학의 외관 이미지와 별 모양의 세포 실체를 정의하는 데 도움이 GFAP 표현을 포함한 간장 별 모양의 세포의 효율적인 격리에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Discussion
간장 별 모양의 세포는 간장에 필수적인 생리와 pathophysiological 프로세스를 조절. 또한, 별 모양의 세포가 그들에게 간장 면역 반응의 중요한 구성 요소를 렌더링, 항원 제시 속성을 보유하고 있습니다. 간장 별 모양의 세포가 간 세포에있는 전체 번호 10~15%을 구성하지만, 이러한 세포의 격리는 쭉 내려 가래의 perisinusoidal 공간에서 자신의 로컬 라이제이션으로 인해 도전이다.
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Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 바이오 메디컬 연구 및 NIH RO1 AI083426 – 01 (FW)에 우수 스미스 가족의 수상에 의해 투자되었다. 패트릭 Maschmeyer와 멜라니 Flach는 Boehringer Ingelheim 재단에서 박사 장학금 지원합니다.
Materials
| Name Of Reagent | Company | Catalog No. |
|---|---|---|
| 70μm Cell Strainer | BD | 352350 |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 |
| DMEM | Gibco | 11960 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv |
| EGTA | Fluka | 3777 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 |
| HEPES | Gibco | 15630 |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | HV-7523-70 |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 |
| Silicone Tube | Masterflex | HV-96440-14 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD | 353108 |
| Winged Infusion Set | Terumo | 1SV27EL |
Referencias
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