星状细胞的七个步骤
Summary
在这里，我们描述了从小鼠肝的肝星状细胞的分离方法。小鼠肝脏星状细胞的纯化，消化<em>原位</em><em>在体外</em>链霉蛋白酶，胶原酶治疗之前，密度梯度离心法。这种技术产生高纯度的肝星状细胞。
Abstract
肝星状细胞是明星般形态的肝居民细胞，并在位于肝窦内皮细胞和肝细胞 1,2之间的狄氏空间。星状细胞来源于骨髓前体和存储总体内维生素A 1，2至80％ 。激活后，星状细胞分化成肌纤维母细胞产生细胞外基质，从而促进肝纤维化3。根据合同的能力，肌纤维母细胞星状细胞能调节血管张力与门脉高压症4相关。最近，我们表明，肝星状细胞是有效的抗原提呈细胞，并能激活NKT细胞以及传统的T淋巴细胞5。
在这里，我们提出了一种从小鼠肝的肝星状细胞的高效制备方法。由于他们的窦周本地化，肝星状细胞的分离是一个多步骤的过程。为了呈现星状细胞Disse间隙隔离， 就地消化酶链霉蛋白酶E和胶原酶体育以下灌注小鼠肝脏灌注，肝组织与链霉蛋白酶E和胶原酶P遭受额外的酶处理体外 。随后，该方法需要大量的维生素A储存在肝星状细胞的脂滴的优势。此功能允许从其他类型的肝细胞在8％Nycodenz梯度离心星状细胞的分离。这里描述的协议产生的星状细胞的高纯度和均匀的人口。纯度可评估染色标记分子胶质纤维酸性蛋白（GFAP），荧光显微镜或流式细胞仪分析前的准备工作。此外，光镜下显示星形海港高量的脂滴的肝星状细胞的独特的外观。
两者合计，我们提出一个详细的协议为有效地隔离对肝星状细胞，包括有代表性的图像，其外观形态和GFAP的表达，有助于确定星状细胞实体。
Protocol
Discussion
肝星状细胞在肝脏调节必不可少的生理和病理过程。此外，星状细胞具有抗原提呈属性，使其肝免疫反应的一个重要组成部分。虽然肝星状细胞在肝细胞总数占10-15％，这些细胞的分离是具有挑战性的，因为他们在狄氏窦周空间的本地化。
在这里，我们提出了一个简单的方法来隔离 ，就地消化和后续梯度离心法从小鼠肝脏中的肝星状细胞。此协议允许适合免疫分析，?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是由史密斯一家在生物医学研究和NIH的RO1 AI083426 – 01（星期六）的卓越奖。帕特里克Maschmeyer和梅拉妮Flach支持勃林格殷格翰基金会博士奖学金。
Materials
| Name Of Reagent | Company | Catalog No. |
|---|---|---|
| 70μm Cell Strainer | BD | 352350 |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 |
| DMEM | Gibco | 11960 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv |
| EGTA | Fluka | 3777 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 |
| HEPES | Gibco | 15630 |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | HV-7523-70 |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 |
| Silicone Tube | Masterflex | HV-96440-14 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD | 353108 |
| Winged Infusion Set | Terumo | 1SV27EL |
Referencias
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