Summary

سبع خطوات لخلايا النجمية

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

نحن هنا تصف طريقة لعزل الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. لتنقية الخلايا النجمية ، يتم هضمها كبد الفأر<em> في الموقع</em> و<em> في المختبر</em> من جانب pronase – كولاجيناز العلاج قبل الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هذه التقنية عالية الغلة نقية الخلايا النجمية الكبدية.

Abstract

الخلايا النجمية الكبدية والكبد وخلايا المقيمين النجوم مثل التشكل وتقع في فضاء Disse بين خلايا الكبد والبطانية الجيبية 1،2 خلايا الكبد. يتم اشتقاق الخلايا النجمية من السلائف نخاع العظم وتخزين ما يصل الى 80 ٪ من فيتامين A الجسم الكلي 1 و 2. عند التنشيط ، والخلايا النجمية تفرق في myofibroblasts لإنتاج المصفوفة خارج الخلية ، مما يسهم في تليف الكبد 3. على أساس قدرتهم على العقد ، يمكن أن الخلايا النجمية myofibroblastic ينظم نغمة الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم يرتبط المدخل 4. مؤخرا ، أظهرت لنا أن الخلايا الكبدية النجمية هي خلايا مولدة قوية ، ويمكن تقديم تنشيط خلايا NKT فضلا عن الخلايا اللمفية تي التقليدية 5.

هنا نقدم طريقة لإعداد كفاءة الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. نظرا لتوطين perisinusoidal بهم ، وعزل الخلايا الكبدية النجمية هي عملية متعددة الخطوات. لجعل الخلايا النجمية للوصول إلى العزلة من مساحة Disse ، يتم perfused كبد الفأر في الموقع مع Pronase E الهضمي الانزيمات وكولاجيناز P. التروية بعد ، يخضع للعلاج أنسجة الكبد الأنزيمية إضافية مع Pronase E و P في كولاجيناز المختبر. في وقت لاحق ، وطريقة الاستفادة من كمية هائلة من قطرات الدهون فيتامين A – تخزينها في الخلايا الكبدية النجمية. هذه الميزة تسمح للانفصال عن غيرها من الخلايا النجمية أنواع الخلايا الكبدية بواسطة الطرد المركزي على التدرج Nycodenz 8 ٪. بروتوكول الموصوفة هنا تعطي السكان نقية جدا ومتجانسة من الخلايا النجمية. ويمكن تقييم نقاء استعدادات لتلوين هذا البروتين علامة الدبقية جزيء ييفي الحمضية (GFAP) ، قبل التحليل المجهري مضان أو التدفق الخلوي. مزيد من الضوء ويكشف المجهر مظهر فريد من النجوم على شكل خلايا الكبدية النجمية التي تؤوي على كميات عالية من الدهون قطرات.

أخذت معا ، نقدم بروتوكول مفصلة للعزلة كفاءة الخلايا الكبدية النجمية ، بما في ذلك الصور ممثل مظهرهم المورفولوجية والتعبير GFAP التي تساعد على تحديد الجهة الخلايا النجمية.

Protocol

وينبغي أن تستخدم C57BL / 6 أسابيع في الفئران 20 ~ من العمر أو المسنين. فمن المستحسن استخدام الفئران الذكور وزنها 25 – 30G. ويمكن زيادة الغلة من الخلايا النجمية عن طريق تغذية الفئران فيتامين A – المخصب الوجبة الغذائية لمدة 2 أشهر قبل نجمي العزلة الخلية. يمكن تنقية حوالي 2×10 5…

Discussion

الخلايا النجمية الكبدية تنظيم العمليات الأساسية الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض في الكبد. علاوة على ذلك ، تمتلك خصائص الخلايا النجمية تقديم المستضد ، جعلها عنصرا هاما من عناصر الاستجابة الكبد المناعي. على الرغم من أن الخلايا الكبدية النجمية تشكل 10-15 ٪ من إجمالي ع…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذا العمل من قبل على جائزة عائلة سميث للتميز في مجال الأبحاث الطبية الحيوية والمعاهد الوطنية للصحة RO1 AI083426 – 01 (مهاجم). معتمدة باتريك Maschmeyer وفلاتش بواسطة ميلاني زمالات الدكتوراه من مؤسسة بورنغير إنغلهايم.

Materials

Name Of Reagent Company Catalog No.
70μm Cell Strainer BD 352350
CaCL2 x 2H2O Sigma-Aldrich C3306
Collagenase P Roche 11249002001
DMEM Gibco 11960
DNase I Roche 10104159001
DPBS Cellgro 21-031-cv
EGTA Fluka 3777
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Gradient Centrifugation Tubes Greiner Bio-One 163160
HEPES Gibco 15630
KCL Sigma-Aldrich P9541
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
L-Glutamine Gibco 25030
MgCl2 x 6H2O Fluka 63068
MgSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich M2773
Na2HPO4 x 2H2O Fluka 71643
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaH2PO4 x H2O Fluka 71507
NaHCO3 Fluka 71628
Nycodenz Accudenz AG AN7050/BLK
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Peristaltic Pump Cole Parmer HV-7523-70
Phenol Red Sigma-Aldrich P4633
Pronase E Calbiochem 7433-2
Silicone Tube Masterflex HV-96440-14
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Tissue culture flask (25cm2) BD 353108
Winged Infusion Set Terumo 1SV27EL

Play Video

Citar este artículo
Maschmeyer, P., Flach, M., Winau, F. Seven Steps to Stellate Cells. J. Vis. Exp. (51), e2710, doi:10.3791/2710 (2011).

View Video