<p class="jove_content"<strong> Benötigte Materialien:</strong> Dissection Stereo-Mikroskop, Doppelseitiges Klebeband, Standard-Objektträger und Deckglas, Dissektionszangen (Größe 5 oder 5,5), weiche Bürste, Silikon Vakuumfett, 5cc Spritze, Whatman-Papier, konfokale oder Epifluoreszenz-Mikroskop mit Digitalkamera und Bild Erfassungs-Software.</p><p class="jove_title"> 1 ist. Puppenstadium Dissection</p><ol><li> Richten Sie ein Kreuz (mit der entsprechenden Kombination von Gal4 Linie und eine GFP markierten Fusionsprotein unter UAS Kontrolle) oder Platz fliegt aus einer Aktie, die Sie möchten, Bild in mehrere frische Fläschchen bei 25 ° C.</li><li> SOP-Zellen beginnen in der Regel auf dem Puppenstadium Thorax vermehren sich 18 Stunden nach Beginn der pupariation wir daher die Option "weißen" Puppen aus den entsprechenden fliegen Aktien-oder überschreiten. Weiße Puppen haben die Puppen Morphologie, sondern haben eine unpigmentierte Puppenhülle, was darauf hinweist, dass innerhalb einer Stunde pupariated.</li><li> Warten Sie etwa 18 Stunden.</li><li> Legen Sie ein Stück doppelseitiges Klebeband auf die Folie. Sammeln Puppen und halten das Puppenstadium Fall dem doppelseitigen Klebeband mit der Bauchseite nach unten. Fassen Sie den Rand des Operculum (die kreisförmige Luke auf der vorderen Rückenflosse Spitze der Puppenhülle) mit der Zange</li><li> Heben, Entfernen und entsorgen Sie die Kiemendeckel und enthüllt die Spitze der unreifen fliegen.</li><li> Verwenden Sie die Zange zu beginnen Reißen entlang der Seite der Puppenhülle. Heben Sie den Mittelteil des Puppenhülle aus dem zerrissenen Seite und bringen Sie es auf die gegenüberliegende Seite, entweder komplett entfernen oder befestigen Sie es auf das Band und enthüllt die Thorax-und vorderen Teil des Bauches. (<strong> Hinweis</strong>: Es gibt eine Kluft zwischen den Entwicklungsländern zu fliegen und die Puppenhülle. Achten Sie darauf, Punktion der Fliege als die Wand der Fall ist zerrissen.)</li><li> Begin Schneiden entlang der gleichen Seite der Puppenhülle zum hinteren Ende. Wieder einmal darauf achten, nicht zu durchstechen the fly. Ziehen Sie die Puppenhülle auf die gegenüberliegende Seite der Fliege und drücken ihn auf die doppelseitigen Klebeband. Der Bauch sollte nun vollständig freigelegt werden. Legen Sie die Soft-Bürste direkt unter dem Kopf der Fliege. Nachdem die Fliege, die Pinsel und frei von der Puppenhülle geklebt wird, mit dem Pinsel vorsichtig aus der Fliege aus der Folie.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Puppenstadium Montage</p><p class="jove_content"> Nach der Präparation sind Puppen dann zwischen Objektträger und Deckglas montiert:</p><ol start="8"><li> Getrennt Puppen von Fall entfernt werden kann dann auf die Mitte des einen Glasträger Dorsalseite bis platziert werden.</li><li> Machen Sie einen quadratischen Rahmen von Whatman-Papier 18x18mm Verlassen eines 10×10 mm Öffnung in der Mitte. Tauchen Sie Papier in Wasser bis zur Sättigung. Legen Sie rund um die Puppen.</li><li> Mit einem 5-ml-Spritze mit Silikon Vakuum Fett gefüllt, tragen Sie eine gleichmäßige Schicht aus Fett rund um die Whatman Rahmen. Die Fettschicht sollte innerhalb der Deckglas fit (Abbildung 1) und die Dicke sollte nur ein wenig größer als der Durchmesser Puppenstadium.</li><li> Setzen Sie einen kleinen Tropfen Wasser (1 ul) auf das Zentrum einer 22×22 mm Deckglas und Ort das Deckglas auf den oben Vorbereitung, so dass die kleinen Wassertropfen die Oberfläche berührt Sie Bild, Notum in diesem Fall). Compress sanft auf eine vollständige Abdichtung von Vakuum Fett und flache Kontaktfläche zwischen dem Deckglas und Puppenstadium Kutikula zu bilden.</li><li> Prep können dann auf invertiert oder aufrecht microcopes abgebildet werden, entweder mit epifluorecence, konfokale (Laser-Scanning-oder Spinning-Disk-Typ) oder Zwei-Photonen-konfokale. Wenn Sie vorsichtig sind, können erwachsenen Fliegen nach einigen Tagen wiederhergestellt werden.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Repräsentative Ergebnisse:</p><p class="jove_content"> Mit Hilfe eines SOP-spezifische Gal4-Linie (<em> Neuralized</em>-Gal4) gekreuzt, um GFP markierte Proteine ​​des mitotischen Spindel (Tubulin oder Tau-GFP) oder Histon-Proteine ​​(H2B-GFP) label, kann man beobachten, Teilungsebene der SOP Zellteilung, Länge des Zellzyklus, oder die Anzahl der mitotischen Divisionen mit Zeitraffer Bildgebung⁹. Andere Fusionsproteine, die Zellorganellen, wie Rab-GTPasen Ziel, verschiedene endocytischen Fächer Marke (Rab5-GFP für frühe Endosomen oder Rab11 GFP für das Recycling Endosomen) oder Proteine ​​wichtig Notch Verordnung (Numb-, Partner von Numb-GFP oder Sanpodo -GFP) können wichtige Einblicke in die Mechanismen der asymmetrischen Zellteilung und Membranprotein Menschenhandel Ertrag^2,3,7,10,11.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Abbildung 1: Puppenstadium Dissektion und Montage. A.</strong> Schritt-für-Schritt-Bilder zeigen die Verfahren, um die Puppenhülle zu entfernen und vorzubereiten intakt Puppen für die Montage und Live Cell Imaging. Puppen sind aus der Flasche entfernt und, Rücken nach oben auf Doppel-Klebeband an einem Glasträger. Erste Spalte, die Entfernung des Operculum und Reißen an der Seite der Puppenhülle. Zweite Spalte, Entfernen von Puppenhülle von Brust-und Bauchbereich. Die freie Puppe wird dann aus dem Puppenstadium Fall mit einem weichen Bürste angehoben.<strong> B.</strong> Montage Puppen zwischen Objektträger und Deckglas. Pupa ist dorsal-Seite nach oben auf den Objektträger aus Glas, umgeben von einem angefeuchteten Rahmen der Whatman-Papier. Eine kontinuierliche Wulst aus Silikon Vakuumfett extrudiert aus einer 5ml Spritze Funktionen zur Abdichtung der Schieber-Deckglas Kombination, zum Schutz der Puppe von Austrocknung und erhebend das Deckglas so sanft ruht auf dem Puppenstadium Thorax. Ein kleiner Tropfen Wasser (1 ul) an der Schnittstelle zwischen dem Deckglas und Thorax Nagelhaut verbessert die Bildqualität deutlich bei der Verwendung von Immersions-Objektive (Wasser oder Öl).<a href="http://www.jove.com/es/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg/"> Klicken Sie hier, um ein größeres Bild anzuzeigen</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Abbildung 2: Repräsentative Bilder von Live-SOP-Zellen und differenzierten externen Sinnesorgane aufgenommen mit unseren Puppen Dissektion und Montageverfahren. A</strong>. Bilder aus einer Zeitreihe eines mitotischen SOP Zelle, die Aktin-GFP-Fusionsprotein unter Kontrolle des extrahierten<em> Neuralized-</em> Gal4 (<em> Neur-</em> Gal4/UAS-actin-GFP), beachten Sie kortikalen Akkumulation von Aktin an der Teilungsfurche (1 Bild / alle 2 Minuten).<strong> B</strong>. SOP Tochterzellen co-exprimierenden Partner von Numb-RFP (rot) und Rab5-GFP angetrieben durch<em> Neuralized-</em> Gal4, beachten Sie die asymmetrische Verteilung von Pon-RFP in einer Tochterzelle (pIIb) und Verteilung der frühen Endosomen in beiden Tochterzellen.<strong> C</strong>. Volume-Rendering eines z-Reihe von differenzierten externen Sinnesorgane zu einem späten Puppenstadium genommen. Cuticle Strukturen, wie mechnosensory Borsten und epidermalen Haare werden durch Nagelhaut Autofluoreszenz (rot) ergeben. Darüber hinaus haben wir die MARCM System verwendet, um LGL-GFP (angetrieben durch ausdrückliche<em> Neuralized-</em> Gal4) in einer Untergruppe von Sinnesorgan Vorläuferzellen (grün). (Diese Bilder wurden alle aufgenommen mit einer Nikon C1 konfokalen Mikroskop mit einem 60X 1,45 NA Objektiv)</p>