<p class="jove_content"<strong> Materiales necesarios:</strong> La disección estéreo-microscopio, la cinta de doble cara, portaobjetos de microscopio estándar y cubreobjetos, pinzas de disección (tamaño 5 o 5.5), cepillo de cerdas suaves, grasa de silicona al vacío, una jeringa de 5 cc, papel Whatman, confocal o microscopio de epifluorescencia con cámara digital y la imagen adquisición de software.</p><p class="jove_title"> 1. La disección de pupa</p><ol><li> Establecer una cruz (con la combinación adecuada de Gal4 línea y una proteína de fusión GFP etiquetados bajo el control de UAS) o moscas lugar de una acción que usted desea la imagen en varios viales fresca a 25 ° C.</li><li> Células SOP generalmente comienzan a proliferar en el tórax de pupa a las dieciocho horas después del inicio de pupariation, por lo tanto, seleccione "blanco" pupas de la mosca de archivo apropiado o cruz. Pupas blancas tienen la morfología pupal, pero tiene un caso de pupa sin pigmentación, lo que indica que tienen que pupariated en una hora.</li><li> Espere aproximadamente 18 horas.</li><li> Coloque un pedazo de cinta de doble cara en la diapositiva. Recoger las pupas y se adhieren el caso de pupa a la cinta de doble cara con la parte ventral hacia abajo. Sujete el borde del opérculo (la escotilla circular en el extremo anterior dorsal de la envoltura pupal) con las pinzas</li><li> Levante con cuidado, quite y deseche el opérculo, dejando al descubierto la cabeza de la mosca de inmaduros.</li><li> Utilice las pinzas para comenzar a romper por el lado de la envoltura pupal. Levante la parte media de la envoltura pupal de la parte rota y llevarlo hacia el lado opuesto, o bien eliminar por completo o se fija a la cinta, dejando al descubierto el tórax y la parte anterior del abdomen. (<strong> Nota</strong>: Existe una brecha entre el desarrollo de la marcha y el caso de pupa. Tenga cuidado de no perforar la marcha como la pared de la caja se rompe.)</li><li> Comienza el corte a lo largo del mismo lado de la envoltura pupal hacia el extremo posterior. Una vez más, tenga cuidado de no perforar la marcha. Tire el caso de pupa en el lado opuesto de la mosca y la prensa que en la cinta de doble cara. El abdomen debe ahora ser totalmente expuesto. Coloque el cepillo de cerdas suaves directamente debajo de la cabeza de la mosca. Una vez que el vuelo se ha quedado atascado en el cepillo y libre de la envoltura pupal, utilice el cepillo para levantar suavemente la marcha de la diapositiva.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Pupa de montaje</p><p class="jove_content"> Después de la disección, las pupas se montan entre el portaobjetos y un cubreobjetos:</p><ol start="8"><lipupas> Aislado retirado de caso, entonces se puede colocar en el centro de un lateral de vidrio dorsal se deslizan hacia arriba.</li><li> Hacer un cuadrado de papel Whatman 18x18mm 10×10 mm dejando una abertura en el centro. Papel de sumergirse en el agua hasta saturación. Lugar alrededor de las pupas.</li><li> Con una jeringa de 5 cc llenos de grasa de silicona vacío, aplique una capa uniforme de grasa alrededor del marco de Whatman. La capa de grasa debe encajar dentro de los cubreobjetos (Figura 1) y el espesor debe ser un poco mayor que el diámetro de pupa.</li><li> Coloque una pequeña gota de agua (1 l) en el centro de un portaobjetos 22×22 mm y colocar el cubreobjetos sobre la preparación anterior de forma que los contactos de agua pequeña gota de la superficie que desea para la imagen, Notum en este caso). Comprimir suavemente para formar un sellado completo de la grasa de vacío y la superficie de contacto plana entre el cubreobjetos y la cutícula pupal.</li><li> Preparación continuación, se puede exponer sobre microcopes invertida o en posición vertical, utilizando epifluorecence, confocal (escaneo láser o girando el tipo de disco) o de dos fotones confocal. Si usted tiene cuidado, las moscas adultas se pueden recuperar después de varios días.</li></ol><p class="jove_title"> 3. Los resultados representativos:</p><p class="jove_content"> Uso de una línea específica SOP-Gal4 (<em> Neuralizadas</em>-Gal4) cruzaron a las proteínas GFP etiquetados con la etiqueta del huso mitótico (tubulina o GFP-Tau) o las proteínas histonas (H2B-GFP), se puede observar el plano de división de la división celular SOP, la duración del ciclo celular, o el número de mitosis divisiones mediante el uso de imágenes a intervalos de tiempo⁹. Otras proteínas de fusión que se dirigen a los organelos celulares como las GTPasas Rab-para marcar los diferentes compartimentos endocítica (Rab5-GFP de endosomas tempranos endosomas o Rab11 las buenas prácticas agrarias para el reciclaje) o proteínas importantes en la regulación de la señalización de Notch (Numb-, socio de Numb-GFP o Sanpodo -GFP) puede dar pistas importantes sobre los mecanismos de división celular asimétrica y el tráfico de proteínas de membrana^2,3,7,10,11.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figura 1: Disección de pupas y de montaje. A.</strong> Paso a paso, las imágenes muestran el procedimiento para quitar la envoltura pupal y preparar las pupas de imágenes de células intactas de montaje y en vivo. Las pupas son de extracción del vial y se colocan, cara dorsal hacia arriba, en cinta adhesiva de doble conectado a un portaobjetos de vidrio. Primera columna, la eliminación del opérculo y cortando a lo largo del lado de la envoltura pupal. Segunda columna, la eliminación de casos de crisálida de la región torácica y abdominal. La pupa libre se alza entonces el caso de las pupas con un cepillo de cerdas suaves.<strong> B.</strong> Montaje de pupas entre portaobjetos y un cubreobjetos. Pupa se coloca dorsal hacia arriba en el portaobjetos de vidrio, rodeada por un marco de papel Whatman humedecido. Un cordón continuo de grasa de vacío de silicona extruida a partir de una jeringa de 5cc funciones para sellar la combinación de diapositivas cubreobjetos, la protección de la pupa de la desecación y la elevación del cubreobjetos para que descanse suavemente sobre el tórax de pupa. Una pequeña gota de agua (1 l) en la interfaz entre el cubreobjetos y la cutícula del tórax mejora significativamente la calidad de imagen cuando se utilizan objetivos de inmersión (agua o aceite).<a href="http://www.jove.com/es/files/ftp_upload/2706/2706fig1_large.jpg/"> Haga clic aquí para ver una imagen más grande</a>.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2706/2706fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figura 2: Imágenes representativas de las células SOP en vivo y diferenciados los órganos sensoriales externos tomadas con nuestra disección de pupa y montaje de procedimiento. A</strong>. Imágenes extraídas de una serie temporal de una célula mitótica SOP expresando actina-proteína de fusión GFP bajo el control de<em> Neuralizadas-</em> Gal4 (<em> Neur-</em> Gal4/UAS-actin-GFP), tenga en cuenta la acumulación de actina cortical en el surco de segmentación (1 image / cada 2 minutos).<strong> B</strong>. Células SOP hija del co-expresión de Socio de Numb-RFP (rojo) y Rab5-GFP conducido por<em> Neuralizadas-</em> Gal4, tenga en cuenta la distribución asimétrica de Pon-RFP en una célula hija (PIIB) y la distribución de los endosomas tempranos, tanto en las células hijas.<strong> C</strong>. Representación de volumen de un z-series tomadas de órganos de los sentidos externos diferenciados en una fase de pupa tarde. Estructuras de la cutícula, como mechnosensory cerdas y pelos epidérmicos son reveladas por la cutícula autofluorescencia (rojo). Además, hemos utilizado el sistema de MARCM expresar Lgl-GFP (impulsado por<em> Neuralizadas-</em> Gal4) en un subconjunto de las células sensoriales del órgano precursor (verde). (Estas imágenes fueron tomadas todas con un C1 Nikon microscopio confocal de barrido con un objetivo 60X 1,45 NA)</p>