ライブラット皮質ニューロンのミトコンドリア膜電位と活性酸素種の定量

1。細胞の培養皮質ニューロンを単離し、前述の技法を用いて成長とポリ- D -リジンとラミニン1でコートしたガラスボトム（マテック（株）、アッシュランド、マサチューセッツ州）で培養皿に播種されています。 2。蛍光プローブTMRMとH 2 DCF – DA用のストック溶液を準備する無水ジメチルスルホキシド1mlにTMRM 5.0 mgを溶解してTMRMの10 mMのストック溶液を調製。 1分間ボルテックスして。その後、アリコートを行い、-20℃に保存する、光から保護し、一ヶ月以内に使用してください。 次に、無水DMSO 1ml中にH 2 DCF – DAの4.87 mgを溶解することによってH 2 DCF – DA 10 – mMのストック溶液を調製。同様に、1分間攪拌のためのそれ。その後、アリコートを行い、-20℃に保存する、光から保護し、一週間以内に使用してください。 3。 TMRMとH 2 DCF – DAでのロードラット皮質ニューロン TMRMは、ミトコンドリアの高度に負に帯電内部に蓄積される電位差、細胞透過性蛍光指示薬です。ミトコンドリアTMRMの自動消光を避けるためにTMRMの低濃度（10〜50 nMの範囲）を使用することが重要です。その後、TMRMの蛍光シグナルはミトコンドリア内膜を通過するΔΨmに直接協力関係することができます。 ΔΨmの消失は、蛍光強度が失われるおそれがミトコンドリアからリークするTMRMなります。 H 2 DCF – DAは細胞透過性の細胞内エステラーゼによってDCF – DAに変換プローブ、および蛍光DCFでの酸化の結果です。高負荷の濃度もH 2の不在O 2におけるDCF蛍光の飽和を引き起こす可能性があるので、DCF – DA 2〜10μMとそれの間の範囲H 2の最終濃度は、異なる脳領域から派生した神経細胞で実験的にテストする必要があります。いかなる内因性または外因性の酸化剤（例えば、一酸化窒素、過酸化水素）の存在は、DFC蛍光強度が増加します。以下、我々はTMRMとH 2 DCF – DAでラット皮質ニューロンをロードするためのプロトコルを提供しています。 TB：：145 mMのNaCl、5mMのKCl、10mMのグルコース、1.5mMのCaCl 2を 、1mMのMgCl 2、および10 TMRMとラット皮質ニューロンをロードするには、まず、タイロードバッファ（テキストオーバーレイで培養神経細胞を3回洗浄mMのHEPES、NaOHで7.4にpHを調整）。その後、結核で1 / 1000倍の10mM TMRMの株式を希釈することによりTMRMの20 nMのを準備して、TBの1mlあたり希薄化後TMRMの2μlを加える。室温、暗所で45分間TMRMと神経細胞をインキュベートします。 45分後、顕微鏡のステージ上に培養皿をマウントし、イメージングを起動します。 H 2 DCF – DAとラット皮質ニューロンをロードするには、結核と培養神経細胞を3回洗浄。次に、TBで10mMのH 2 DCF – DA株式1 / 10倍に希釈してH 2 DCF – DAの2μMを準備して、TBの1mlあたり希薄化後のH 2 DCF – DAの2μlを加える。その後、室温で暗所で45分間H 2 DCF – DAを持つニューロンをインキュベートする。 45分後、画像を取得する前に、余分な蛍光指示薬を削除するには、結核と神経細胞を4回洗浄する。 4。 ΔΨmを決定するためにTMRMとともにインキュベートした神経細胞のイメージングを生きる TMRMとともにインキュベートした神経細胞のライブイメージング、共焦点レーザー走査顕微鏡（テキストオーバーレイ：LSM 510、カールツァイス社）を実行するために、ライブの時系列のプログラムのアプリケーションとを、使用されています。画像を取得し、退色を避けるために必要な時間を最小限に抑えるために：、低解像度と減衰レーザーパワー（1％：低解像度レーザパワー256 × 256テキストオーバーレイ）を適用します。 。次に、反射光を使用してTMRMでロードされたマウントされているニューロンのフォーカスを調整します。 514 nmで照射し、570nmで検出によるTMRM蛍光を調べます。ちょうど飽和レベル以下のカメラの検出のゲインを設定します。 一度画像を得るために解像度、レーザーパワー、カメラの検出のゲイン、およびタイムラプス間隔を含むすべてのパラメータが設定されています。実験間でこれらの設定を変更しないでください。次に、フィールドを変更します。画像の収集を開始。 ΔΨmの変更をテストするには、そのようなFCCPまたは2μgの/オリゴmlの、1μMのような刺激が著しく、それぞれ、ミトコンドリア膜電位を脱分極や過分極となる、適用することができます。これらの変更は、FCCPの場合にはベースライン蛍光強度と比較してTMRM蛍光強度の減少、またはオリゴマイシンの場合にTMRM蛍光強度の増加が反映されます。 5。 ROSを決定するためにH 2 DCF – DAとインキュベートした神経細胞のライブイメージング H 2 DCF – DA、最初にインキュベートニューロンのライブイメージングを実行するには、顕微鏡のステージ上に培養皿をマウント。私たちの細胞のフォーカスを調整しますINGは、反射光を。 488 nmで励起と515 nmの放射によるDCFの蛍光を調べる。 次に、5-7％、検出器のゲイン、および256 × 256の解像度にレーザーパワーを調整する。実験間でこれらの設定を変更しないでください。その後、時系列のプログラムを使用してライブ映像を得るために周波数を設定します。 新しいフィールドを選択して、画像を取得開始します。 ROSレベルの変化を検出するには、H 2 O 2の100から200μMで細胞を扱う。これは、ベースラインレベルと比較してDCF蛍光強度の増加が反映されます。 6。データの分析エリアを選択するLSMのプログラムからツール：関心領域を（ROIテキストオーバーレイ）を使用してください。その後、TMRMまたはROS蛍光強度を測定する。それぞれ、TMRMまたはROSの蛍光強度を測定するために撮像された細胞の全体の細胞体からミトコンドリアの地域またはROIのからROIを選択してください。 TMRM用または各時間ポイントのROSのすべての画像形成されたセルのための全体の細胞体からの各セルのすべてのROIの平均蛍光強度を計算する。バックグラウンドの蛍光強度を計算するセルの隣の領域を選択します。いくつかの測定を行い、平均バックグラウンド強度を計算する。 Microsoft Excelを使用して、各時間ポイントの各セル内のROIの平均蛍光強度から平均的なバックグラウンドの蛍光強度を引きます。バックグラウンド強度を差し引いた、この式を用いてベースラインの蛍光（：=ベースライン蛍光の任意の時点でFが=蛍光強度、ΔF= FF O / F O × 100、テキストオーバーレイ）にTMRMまたはDCF蛍光強度を正規化する。その後、時間の経過とともに蛍光強度の変化を示すグラフを生成するシグマプロットプログラムを使用します。 7。代表的な結果図1Aは、TMRMとインキュベートラット皮質ニューロンの蛍光画像を示しています。 FCCP、ミトコンドリア脱共役剤、の添加は、ミトコンドリアの脱分極とTMRM蛍光強度（図1B）の損失につながる。ベースラインTMRMの蛍光レベルは、FCCPの添加（。;図1C第一350秒）の前に安定している。時間をかけてTMRM蛍光変化の定量分析は、FCCP（図1C）の添加後TMRMの蛍光の有意な減少を示しています。 図1Dは、DCFを搭載したラット皮質ニューロンの蛍光画像を示しています。細胞体の増加DCF蛍光強度（図1E）のH 2 O 2の添加により。ベースラインDCF蛍光レベルは、H 2 O 2のアプリケーションの前に（最初の120秒）変更されていません。 DCF蛍光の経時的測定は、着実なレベルを示し、H 2 O 2処理（図1F）の後にどの増加。 図1。ミトコンドリア膜電位とライブラット皮質ニューロンのROSレベルの評価。 TMRMを搭載した皮質ニューロンの（A）代表蛍光画像。ベースラインTMRM蛍光をスキャンした後、神経細胞はprotonophore FCCP（1μM）で処理した。右側にはそれぞれ、明るい黄色と表す黒の最大値と最小輝度とTMRM蛍光の疑似強度バーです。ミトコンドリアの領域からTMRMの蛍光の消失は、FCCP治療（パネルB）に応じてΔΨmの崩壊を示している。異なる時点でTMRM蛍光強度の変化の定量的表現は、FCCPの治療の前と後のパネルC.（D）でH2DCF – DAを搭載したラット皮質ニューロンの蛍光画像を示しています。ベースラインDCF蛍光を決定した後、細胞を200μMのH 2 O 2で処理し、及びDCF蛍光の変化を評価した。 DCF蛍光の増加は、H 2 O 2処理（E）に応じてROSレベルの増加を反映している。 DCF蛍光の変化の定量分析、H 2 O 2処理の前後には、パネルF.スケールバーに=10μmを示しています Video.7.1 – labmedia 2704_Joshi.avi 40倍対物レンズを用いてFCCPを添加する前と後の皮質ニューロンにおけるTMRMの細胞イメージングを生きる。擬似カラーの強度は、FCCPの添加後（赤色、FCCPの添加後の）最大値（FCCPの添加前に、明るい黄色、）と減少TMRM蛍光強度を示しています。 ビデオを表示するにはここをクリック ビデオ。 7.5 – labmedia 2704_Joshi.avi 40倍対物レンズを用いてH 2 O 2を添加する前と後の皮質ニューロンにおけるDCFの細胞イメージングを生きる。ベースラインDCF蛍光は、細胞体にライトグリーン色をしているとH2O2添加は、DCを増加させる鮮やかな緑色にF蛍光強度は。 ビデオを表示するにはここをクリック