Biomolekulare Erkennung Einsatz der Interferometrische Reflectance Imaging Sensor (IRIS)

1. Untergrundvorbereitung Coat geschichtete Silizium-SiO 2-Substraten mit Selbst-Adsorption Copoly (DMA-NAS-MAPS): Copolymer-Synthese, chemische Struktur und Coating-Verfahren sind publiziert in: G. Pirri, F. Damin, M. Chiari, E. Bontempi, LE Depero. Charakterisierung eines polymeren Adsorbed Coating für DNA Microarray Slides Glas. Anal. Chem. 2004, 76, 1352-1358. Kurz gesagt, bereiten Polymerlösung durch Zugabe von 100 mg des Polymers zu 5 ml deionisiertem Wasser (DI) und mit 5 ml 40% gesättigtem Ammoniumsulfat ((NH 4) 2 SO 4)-Lösung auf eine Endkonzentration von 0,92 M. zu erreichen Tauchen Sie Chips in-Lösung für 30 min auf einem Schüttler und dann gründlich mit VE-Wasser. Dry gründlich mit Argon / N 2-Gas. Bake-Chips bei 80 ° C für 15 min. Shop-Polymer-beschichtete Substrate / Chips in einer trockenen Umgebung (Vakuumexsikkator) für bis zu 3 Monaten bis Sonde Spotting Verfahren. 2. Vorbereitung der Probe Array: Antikörper, Antigene, ss / dsDNA, RNA, etc. Verdünnen Sie die Sonde (n) geeignete Konzentration in der gewünschten Puffer. Dieser Schritt kann erheblich variieren, aber ein typisches Experiment nutzt Antigen oder IgG in einer Konzentration von 0,5 mg / ml (Bereich von 0,1 -1 mg / mL) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) bei pH ≈ 7,4. Place Lösungen in einer 96 – oder 384-Well-Platte (oder Standard-Source-Platte für den Spotter verwendet wird) Setup-Spotting-Parameter für die gewünschte gedruckt Array: Bestimmung der geeigneten Spotting-Parameter für die Oberfläche und Lösungen verwendet wird (Verweilzeiten, Annäherungsgeschwindigkeiten, etc.). Bestimmen Sie die Anzahl der Wiederholungen der einzelnen Bedingung pro Raster, die Grid-Layout, die Anzahl der zu replizieren Gitter, und die gewünschte Spotting Lage auf dem Chip. Legen Substrate und Quelle Platte an den entsprechenden Stellen, stellen Sie sicher, Abfall-und Vorratsflaschen sind bereit, und dem Druck beginnen laufen. Nach Spotting fertig ist Platz Substrate in einer Umgebung mit hoher Feuchtigkeit über Nacht (4-18 Stunden), damit Immobilisierung und Deaktivierung durchgeführt werden soll. Wash Substrate: legen Sie sie in den folgenden Lösungen für die drei Minuten für drei separate Wäschen: PBS mit 0,1% Tween (PBST), PBS und schließlich deionisiertem Wasser (DI). Je nach der Art des Experiments (wet vs trocken), trocken der Chip gründlich mit Argon Gas und beginnen Inkubation oder den Chip in einer Flusskammer und zu montieren. Deaktivieren verbleibenden NHS-Gruppen auf Copolymer Oberfläche durch Eintauchen der Chips in einem 50 mM Lösung von Ethanolamin mit dem pH-Wert eingestellt auf 7,4 für 30 Minuten, während auf einem Schüttler Platte. Ein primäres Amin-haltige Verbindung wie Hydroxylamin oder Tris können ebenfalls verwendet werden, solange die vorbereitete Lösung ist sicher, mit Proteinen verwendet werden. Spülen Sie die Deaktivierung Lösung mit PBS dann VE-Wasser. Optional Schritt (abhängig von der Oberflächenchemie zu beschäftigt): Block Oberfläche mit einer Lösung von BSA, Casein oder rehydriert Milch für 30 Minuten. Für das laufende polymeren Oberflächen-Chemie, die wir verwenden, haben wir diesen Schritt nicht ausführen, wie das Polymerrückgrat wirkt, um nicht-spezifische Protein-Bindung zu verhindern. 3. Datenerfassung und-Incubation Vorgehensweise: Endpoint-Format Machen Sie eine Lösung des Ziels von Interesse in der gewünschten Puffer. Hier wird es eine Lösung des entsprechenden Konzentration von Anti-BSA in PBS (: make 1-10 mL einer 10 ng / ml-Lösung von Anti-BSA in PBS ex) werden. Stellen Sie außerdem sicher, um eine äquivalente Menge an Puffer (ohne Ziel) für die negative Kontrolle Inkubationszeit haben. Werfen Sie einen Silizium-Spiegel-Scan für die Normalisierung der alle nachfolgend erhobenen Daten. Scan der vorbereiteten Probe Array mit dem IRIS-System vor der Inkubation Schritt, um die erste optische Höhe (Masse) an jedem Ort zu bestimmen. Dies wird für eine ordnungsgemäße Analyse von Veränderungen in der Masse auf der Oberfläche zu ermöglichen, dh der Grad der Bindung, nach der Inkubation. Hier werden einige Parameter für das laufende Experiment, wie Belichtungszeit, Sichtfeld, prosperierenden konzentrieren, etc. eingestellt werden Tauchen Chip (s) in vorbereitete Lösung für 1 Stunde auf einem Schüttler Platte. Die Inkubationszeit kann variieren stark je nach dem Grad der Erregung, die Konzentration der Ziel erkannt, die Transporteigenschaften der Flusskammer (wenn eine Echtzeit-Erkennung-Modus verwendet wird), die Affinitäten der Target-Sonden-Paar, etc . Nach der Inkubationszeit, wiederholen Sie den Waschvorgang in Schritt 2.5 beschrieben) Scan der gleichen Sonde Array mit dem IRIS-System und erhalten nach der Inkubation Bilder für Vorinkubation Vergleich. Wiederholen Sie diesen Vorgang für verschiedene Inkubationsschritte wenn nötig, zum Beispiel in einem Sandwich-Assay-Format, wo ein sekundärer Antikörper verwendet wird. 4. Data Analysis Fit die gesammelten Bilder für jede IRIS-Scan (Reihenfolge der Intensität Bilder), mit dem Labor-entwickelten Software zur ProDuce ein Bild von der Sonde Array mit optischen Dicke Informationen. Eine schnelle qualitative Analyse der Bindung kann durch Subtraktion (eingetragene) Post-und Pre-Inkubation Bilder durchgeführt werden. Binding wird als eine Änderung in der Intensität an den Stellen, wo Masse Veränderungen beobachtet erscheinen. Für die quantitative Analyse ermitteln Massendichten jeder Stelle im Vergleich zum Hintergrund durch Mittelung optische Dicke Informationen für jedes Pixel in einem Spot-und einen Ring außerhalb des Ortes und machen einen direkten Vergleich dieser beiden Bereiche. 5. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1 zeigt ein Beispiel schematische Darstellung des geschichteten Si-SiO 2 IRIS Substrat mit einem Vertreter Antikörper Array entdeckt. Jeder Antikörper Ensemble ist in replizieren mit Spezifität für ein anderes Epitop gezielt verschiedene Proteine ​​entdeckt. Zwei verschiedene ganze Viren und ein virales Protein als Beispiel Ziele vertreten. Negative Kontroll-Antikörper richten sich nach dem Test und kann nicht-spezifische und / oder Virus-spezifisch. Abbildung 2 zeigt die Bindung von humanem Serum Albumin (HSA)-spezifische Antikörper gegen eine Reihe von spotted HSA und Kaninchen IgG (Kontrolle) Flecken. Wie hier zu sehen, nach der Montage und Bestimmung der optischen Dicken für die Pre-und Post-Inkubation Bilder, kann einen Unterschied Bild für die Bindung Array erstellt qualitativ beurteilen verbindlich. Die quantitative Analyse zeigt, dass ein 2,05 und 0,13 Nanometer mittlere optische Höhenänderung für die HSA und Kaninchen-IgG-Spots wurde beobachtet, die für eine Anti-HSA Inkubation Konzentration von 500 ng / mL. Abbildung 3 zeigt ein IRIS Messung Fur Proteinbindung Abhängigkeit von Proteinkonzentration und dsDNA Oligomer Länge. Die obere Grafik zeigt absolute optische Höhenmessungen für die erste immobilisierten Oligomers Sonde Höhen-und Post-Inkubation Fur bindend. Steigende Konzentrationen von Pelz (50, 100, 200 nM) führte zu einer erhöhten Bindung an DNA-Sonden. Die Länge der Oligomere auch Auswirkungen Fur Bindung mit längeren Sequenzen was zu mehr bindend. Hier sind auf Fehler und Bars eine Standardabweichung vom Mittelwert. Die untere Kurve zeigt berechnet Fur-Protein-Dimer binden pro dsDNA Strang. Dimer-Bindung wurde deutlich bei einem Fur-Protein-Konzentration von 200 nM auf eine hohe Ebene der nicht-spezifische Bindung erhöht. Abbildung 1. Schematische Darstellung eines Beispiels Sondenarray normalerweise in einem Experiment zur spezifischen Viren und viralen Komponenten in einem Multiplex-Mode mit dem IRIS-System erkannt werden. Abbildung 2. Post-Inkubation Unterschied die Grafik für eine Bindung von humanen Serum-Albumin-spezifischen Antikörpern gegen gesichtet HSA mit diesem Label-free-System bei einer Konzentration von 500 ng / mL gesammelt. Das Biomaterial Massendichte für jeden Fleck wird durch Mittelung optische Dicke Informationen innerhalb einer Stelle und dann einen Vergleich mit dem Durchschnitt von einem Ring um den Ort, die den Hintergrund bestimmt. Abbildung 3. Plot der Bindung von Daten für die Fur-Protein-Wechselwirkungen mit gefleckten doppelsträngige Oligomere mit einem bekannten Konsensus-Sequenz auf Oligomer Länge, Lage der Konsensus-Sequenz innerhalb des Oligomers und Fur-Protein-Konzentration. Informationen über die absolute Höhe der Fur-Protein gebunden, um jedes entdeckte Sequenz (oben) können verwendet werden, um die Zahl der Pelz-Dimere gebunden an jede Art von Oligomer (unten) zu schätzen.