Вторжение клеток человека от бактериальных патогенов

Следующий протокол будет описывать изучение эндотелиальной вторжение ячейки С. золотистый, но теоретически может быть использован для изучения сотовой вторжения любой culturable бактерии. Этапы характерных для С. золотистого и эндотелиальных клетках указаны. 1. Подготовка бактерии Культура С. золотистого штаммов для 4-16 ч (в зависимости от фазы роста требуется) в 10 мл сердечно-мозговой инфузии (BHI) бульоне при температуре 37 ° С на воздухе при встряхивании со скоростью 200 оборотов в минуту. Эти условия роста являются специфическими для S. золотистого и, возможно, должны быть адаптированы для других бактерий. Вымойте бактерий три раза в среде Дульбекко изменения Орла (DMEM; Invitrogen) попеременным раундов центрифугированием при комнатной температуре (5000 х г, 10 мин), удаление супернатанта культуры и ресуспендирования бактериальных гранул в эквивалентный объем DMEM. Измерьте оптическую плотность Полученную суспензию бактерий, которые затем могут быть скорректированы по мере необходимости. Для С. стафилококк, мы готовим подвески на OD 600 = 1, что соответствует ~ 10 9 КОЕ мл -1. 2. Эндотелиальная культуры клеток Культура эндотелиальной клеточной линии EA.hy926 1 в DMEM дополнена фетальной телячьей сыворотки (FBS; 10%) и L-глютамин (2 мМ) при 37 ° С в 5% СО 2. Кроме того, объединенных первичная пупочной вены человека эндотелиальных клеток (HUVECs) можно приобрести у Lonza (Базель, Швейцария) и культивировали в эндотелиальной базальной среде с добавлением 2% ЭТС, бычий экстракт мозга (включая гепарин), человеческий фактор роста эндотелия и гидрокортизон при 37 ° С в 5% CO 2 в соответствии с инструкциями производителя (Lonza). Эти условия роста являются специфическими для этих клеток и, возможно, должны быть адаптированы к другим типам клеток хозяина. Расти эндотелиальных клеток в колбах T75 для завершения слияния, проверено на глаз. Подготовка 24-луночных планшетах для вставки покровные. Изобразительное щипцы (пламя стерилизованные) необходимы для перемещения покровных, которые имеют один непрозрачный и один блестящей поверхностью. Место покровных в лунки 24-луночного планшета с непрозрачной поверхностью вверх, чтобы клетка привязанности. Освободить клетки T75 колбу с 3 мл трипсина-EDTA (0,25%) и добавьте к 10 мл соответствующих питательной среды. Добавить 500 мкл ресуспендировали клетки 24-луночного содержащие покровные Thermanox стекла. Один T75 сливной колбу клеток, при условии достаточной клеток для двух 24-луночных планшетах, в результате чего около 5 × 10 5 клеток на лунку (в 500 мкл среды). Инкубируйте пластин в течение 48 ч, как описано выше, и проверить 100% клетка слияния с помощью инвертированного микроскопа свет. Dip-покровных мыть в ФБС и добавить в новый 24-луночного содержащие 490 мкл DMEM, содержащей 10% FBS в каждую лунку. Для изучения роли конкретных метаболических процессов в ячейке вторжения, ингибиторы могут быть добавлены в культуре клеток 1 час до того бактерий и концентрации сохраняется в течение теста. Например, чтобы определить роль актина перестановки в S. золотистого вторжения в эндотелиальных клетках, 50 мкМ цитохалазином D могут быть добавлены, или на роль кавеол, 5 мМ метил-β-циклодекстрина могут быть добавлены. 3. Вторжение Пробирной Добавьте 10 мкл мыть бактерий (в результате чего примерно 2 × 10 7 КОЕ мл -1 золотистого стафилококка) в каждую лунку содержащие мыть покровное с вырожденным слоем эндотелиальных клеток в 490 мкл DMEM, содержащей 10% FBS. Инкубируйте 15-90 минут при температуре 37 ° С в 5% СО 2. Для измерения общего количества бактерий, связанных с клетками (приверженца и внутреннюю), ближнего мыть покровные три раза PBS и добавить к свежим скважин, содержащую 500 мкл 0,5% Тритон Х-100 в PBS. Для обеспечения клетки полностью лизировать и освободить всех внутренним бактерий, пипетки несколько раз, указывая кончиком пипетки непосредственно на поверхность покровным. Перечислять бактерий при посеве жидкой суспензии (или разведения этого в случае необходимости) на поверхности пластин АСП. Так как TX-100 будет лизировать многие грамотрицательные бактерии, сапонин может быть использован вместо 2. Чтобы измерить количество интернализованных бактерий, удалить супернатант культуры из каждой лунки, содержащие бактерии несвязанных и заменить 500 мкл DMEM/10% FBS дополнен 200 мкг мл -1 гентамицин. Мы обычно используют гентамицин, а не лизостафина здесь, как это дешевле и позволяет переключаться между эксперименты с использованием различных видов бактерий (например, стафилококки и лактококков) без необходимости изменения протоколе исследования. Инкубируйте пластин при 37 ° С в 5% CO 2 в течение 60 минут, чтобы убить всех внеклеточных бактерий. Вымойте покровные 3 раза PBS,лизировать и перечислить при посеве на АСП, как описано для адгезии анализ выше. В некоторых случаях может оказаться предпочтительным, чтобы визуально подсчитать количество бактерий с помощью светового микроскопа. В этом случае, а также конкретные С. Вторжение золотистого ячейки, используйте лизостафина (10 мкг мл -1) вместо гентамицина физически уничтожить внеклеточных бактерий. Инкубируйте покровные для 20 минут при температуре 37 ° C в CO 2 в растворе лизостафина, затем смойте и зафиксировать Cytopath (Cellpath). Потоп покровные кристаллическим фиолетовым (0,5%, в / о) за 5 мин. Dip-промыть в воде, воздушно-сухой и смонтировать на стеклах. Число бактерий в мм 2 вырожденных эндотелиальных клеток может быть определена количественно с помощью светового микроскопа. 4. Представитель Результаты: Выражение фибронектина связывающих белков (FnBPA и FnBPB) на поверхности S. золотистого дает возможность вторгнуться в эндотелиальных клетках. Последние работы пересмотрел фибронектин-связывающий домен FnBPA 3. Дикого типа (WT) С. золотистого 8325,4 вторгается в эндотелиальных клетках с высокой эффективностью, в то время как напряжение отсутствует FnBPA и B (Δ FNB) показали значительно снижение уровня интернализации (рис. 1А). Комплементации мутанта с плазмидой FNB кодирования минус фибронектин-связывающий домен (pFnR0) не способствовало вторжение (рис. 1А). С другой стороны, дополняемости мутант с плазмидой, кодирующей всей FNB гена (pFnBA4) восстановил вторжение WT уровня (рис. 1А). Роль FnBPA в эндотелиальных вторжения ячейка может быть также продемонстрированы с использованием гетерологичных Лактис хост выражение Lactococcus. Выражение плазмиды в кодировке FnBPA в L. Лактис (pRM9 9) не значительно повысить сцепление с эндотелиальных клеток по сравнению с бактериями выражения не FnBPA (CTL) (открыты бары, рисунок 1В). С другой стороны, FnBPA экспрессирующих Л. Лактис вторглись в эндотелиальных клетках при значительно более высоких уровнях, чем не выразив напряжение (закрытые бары, рисунок 1В). Эксперименты проводились четыре раза в двух экземплярах и среднее ± стандартное отклонение представлена. * Представляют данные, которые статистически значимо отличается (р = <0,05) от WT или CTL ценностей. Рисунок 1. Вторжение EA. Hy926 эндотелиальных клеток С. стафилококк () или L. Лактис (B).