ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis einer DNA Microarray für Influenza
Summary
ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis Technologie wird als eine kostengünstige Alternative zu Fluoreszenzdetektion für Mikroarrays vorgestellt. Basierend auf Photopolymerisation, produziert ampliPHOX festen Polymer-Spots, die mit bloßem Auge in nur wenigen Minuten. Die Ergebnisse werden dann abgebildet und automatisch interpretiert mit einer einfachen, aber leistungsstarken Softwarepaket.
Abstract
DNA-Mikroarrays wurden als ein mächtiges Werkzeug für den Erregernachweis entstanden. 1-5 So viele Beispiele für die Fähigkeit, Typ und Subtyp Influenza-Virus nachgewiesen wurden. 6-11 Die Identifizierung und Subtypisierung von Influenza auf DNA-Mikroarrays wurde Anwendungen sowohl im öffentlichen Gesundheit und die Klinik für die Früherkennung, die ein rasches Eingreifen und die Minimierung der Auswirkungen einer Influenza-Pandemie. Traditionelle Fluoreszenz ist derzeit die am häufigsten verwendeten Microarray-Nachweisverfahren. Doch wie Microarray-Technologie schreitet in Richtung klinische Anwendung, 1 ersetzt teure Instrumente mit geringen Kosten-Detection-Technologie präsentiert ähnlichen Leistungsmerkmalen zur Fluoreszenz wird Microarray-Assays attraktiver und kostengünstiger.
Die ampliPHOX kolorimetrischen-Detection-Technologie ist für die Forschung Anwendungen gedacht und hat eine Nachweisgrenze innerhalb einer Größenordnung von traditionellen Fluoreszenz 11, mit einem Vorteil wird eine ungefähre zehnfach niedrigeren Gerätekosten im Vergleich zum konfokalen Mikroarray-Scanner für Fluoreszenz-Mikroarray erforderlich Erkennung. Ein weiterer Vorteil ist die kompakte Größe des Instruments, die für Portabilität und Flexibilität ermöglicht, im Gegensatz zu herkömmlichen Fluoreszenz-Instrumente. Da die Polymerisation Technologie ist nicht als inhärent linear als Fluoreszenz-Detektion ist es jedoch am besten für geringere Dichte Microarray-Anwendungen, bei denen eine Ja / Nein Antwort auf das Vorhandensein einer bestimmten Sequenz gewünscht wird, wie für den Erregernachweis Arrays geeignet. Derzeit die maximale Spotdichte mit ampliPHOX Erkennung ~ 1800 Punkte / array. Wegen der Spotdichte Einschränkungen sind höhere Dichte Microarrays nicht geeignet für ampliPHOX Erkennung.
Hier präsentieren wir ampliPHOX kolorimetrischen-Detection-Technologie als eine Methode der Verstärkung von Signalen auf eine geringe Dichte Microarray für die Detektion und Charakterisierung von Influenza-Viren (FluChip) entwickelt. Obwohl dieses Protokoll nutzt die FluChip (ein DNA-Microarray) als eine spezifische Anwendung des ampliPHOX-Erkennung, eine Microarray Einbeziehung biotinylierten Ziel kann beschriftet und in ähnlicher Weise erkannt werden. Die Microarray-Design und Biotinylierung des Ziels zu erfassen liegen in der Verantwortung des Nutzers. Sobald die biotinylierten Ziel ist auf dem Array erfasst wurde, kann ampliPHOX Erkennung durch erste Tagging durchgeführt werden das Array mit einem Streptavidin-label-Konjugat (ampliTAG). Nach Belichtung mit dem ampliPHOX Reader Instrument, Polymerisation einer Monomerlösung (ampliPHY) tritt nur in Regionen mit ampliTAG-markierten Ziele. Das gebildete Polymer kann anschließend mit einem ungiftigen Lösung visuellen Kontrast zu verbessern, indem Abbildung und Analyse mit einem einfachen Software-Paket (ampliVIEW) gefolgt gefärbt werden. Die gesamte FluChip Assay von un-extrahierten Probe bis zum Ergebnis kann in etwa 6 Stunden durchgeführt werden, und die ampliPHOX Erkennung oben beschriebenen Schritte können in ca. 30 min abgeschlossen sein.
Protocol
Discussion
Die ampliPHOX kolorimetrischen Nachweis hier vorgestellte Technologie ist eine schnelle und kostengünstige Alternative zu einfarbigen Fluoreszenzdetektion für geringere Dichte Microarray-Anwendungen. Schematisch in Abbildung 1 dargestellt, ist der Nachweis grundsätzlich auf die Verwendung eines Photoinitiators Label (1B) basiert. In der Gegenwart eines Monomer-haltigen Lösung (1C), bewirkt Belichtung der Photoinitiator (ampliTAG), um eine Polymerisationsreaktion nur in gekennzeichneten Bereichen (1D…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
InDevR erkennt NIH / NIAID U01AI070276 und R43AI077112 für die Finanzierung dieser Arbeit.
Materials
| Reagent/equipment | Manufacturer | Catalog # | Comments |
|---|---|---|---|
| Qiagen MinElute Virus Spin Kit | Qiagen | 57704 | single 60 μl elution |
| QIAcube | Qiagen | 9001292 | optional |
| ABI 9800 Fast Thermal Cycler | Applied Biosystems | 4441166 | |
| Qiagen OneStep RT-PCR kit | Qiagen | 210210 | kit dNTPs not used |
| 2x Spotting Buffer | InDevR Inc. | MI-5007 | |
| Biotinylated dNTP Mix | InDevR Inc. | MI-5009 | |
| Lambda exonuclease | Epicentre Biotechnologies | LE032K | 2500 U, 10U/μl |
| FluChip primer mix | InDevR | N/A | not yet available for sale |
| Orbital Shaker | Madell Technology | ZD-9556-A | |
| Wash Bins | InDevR Inc. | MI-4002 | |
| Wash Racks | InDevR Inc. | MI-4003 | |
| 2x Hybridization Buffer | InDevR Inc. | MI-5004 | |
| Calibration Chips | InDevR Inc. | AP-5006 | |
| Wash Buffers A-D | InDevR Inc. | MI-5005 | |
| ampliRED | InDevR Inc. | AP-5004 | |
| ampliTAG | InDevR Inc. | AP-5001 | |
| 2x ampliTAG Buffer | InDevR Inc. | AP-5002 | |
| ampliPHY, ampliPHY enhancer | InDevR Inc. | AP-5003 |
Referencias
- Kumar, R. M. The Widely Used Diagnostics “DNA-Microarray”-A Review. Amer J Inf Dis. 5, 207-218 (2009).
- Miller, M. B., Tang, Y. W. Basic Concepts of Microarrays and Potential Applications in Clinical Microbiology. Clin Microbiol Rev. 22, 611-633 (2009).
- Mikhailovich, V., Gryadunov, D., Kolchinsky, A., Makarov, A. A., Zasedatelev, A. DNA microarrays in the clinic: infectious diseases. BioEssays. 30, 673-682 (2008).
- Call, D. R. Challenges and opportunities for pathogen detection using DNA microarrays. Crit Rev Microbiol. 31, 91-99 (2005).
- Raoult, D., Fournier, P. E., Drancourt, M. What does the future hold for clinical microbiology. Nat Rev Microbiol. 2, 151-159 (2004).
- Dawson, E. D., Rowlen, K. L., Wang, Q., Tao, Y. J. MChip: A Single Gene Diagnostic for Influenza A. Influenza: Molecular Virology. , (2010).
- Gall, A., Hoffman, B., Harder, T., Grund, C., Ehricht, R., Beer, M. Rapid hemagglutinin subtyping and pathotyping of avian influenza viruses by a DNA microarray. J Virol Meth. 160, 200-205 (2009).
- Townsend, M. B., Dawson, E. D., Mehlmann, M., Smagala, J. A., Dankbar, D. M., Moore, C. L., Smith, C. B., Cox, N. J. FluChip: Experimental evaluation of a diagnostic influenza microarray. J Clin Microbiol. 44, 2863-2871 (2006).
- Wang, Z., Daum, L. T., Vora, G. J., Metzgar, D., Walter, E. A., Canas, L. C., Malanosky, A. P., Lin, B., Stenger, D. A. Identifying influenza viruses with resequencing arrays. Emerg Inf Dis. 12, 638-646 (2006).
- Kessler, N., Ferraris, O., Palmer, K., Marsh, W., Steel, A. Use of the DNA Flow-Thru Chip, a three-dimensional biochip, for typing and subtyping of influenza viruses. J Clin Microbiol. 42, 2173-2185 (2004).
- Kuck, L. R., Taylor, A. W. Photopolymerization as an innovative detection technique for low-density microarrays. Biotechniques. 45, 179-186 (2008).
- Avens, H. J., Bowman, C. N. Development of fluorescent polymerization-based signal amplification for sensitive and non-enzymatic biodetection in antibody arrays. Acta Biomat. 6, 83-89 (2010).
- Sikes, H. D., Jenison, R., Bowman, C. N. Antigen detection using polymerization-based amplification. Lab on a Chip. 9, 653-656 (2008).
