Inductie van allogeen-specifieke anergie in humane perifere bloed mononucleaire cellen door allogeen stimulatie met Co-stimulerende signaal blokkade

<p class="jove_title"> 1. Voorbereiding van de PBMC</p><ol><li> Procedures voor een goede aseptische techniek en de universele voorzorgsmaatregelen moeten worden nageleefd tijdens de uitvoering van dit protocol.</li><li> Isoleer PBMC van gezonde vrijwillige donoren door de dichtheid gradiënt centrifugatie met behulp van Ficoll-Hypaque. Als alternatief gecryopreserveerde PBMC kan worden gereanimeerd.</li><li> Count levensvatbaar PBMC na kleuring met trypan Blue met behulp van een hemocytometer. Resuspendeer PBMC in complete cultuur media (CM) bij een concentratie van 1 miljoen levensvatbare cellen / ml in een 15 ml Falcon buis.</li></ol><p class="jove_title"> 2. Instellen van de Bulk Alloanergizing Co-cultuur</p><ol><li> PBMC's van twee verschillende donoren zijn nodig om het opzetten van de alloanergization culturen. Cellen van een donor zal dienen als de responder en cellen van een andere donor zal fungeren als de stimulator (aangeduid als de eerste partij stimulator).</li><li> Plaats 10 miljoen stimulator PBMC op 1 miljoen / ml in een 15 ml Falcon buis en voeg 100 mg van anti-B7.1 en 100mg van anti B7.2 antilichamen tegen costimulatie blokkeren. Schud voorzichtig de buis en incubeer gedurende 30 minuten. Incubatie voorwaarden voor deze en alle volgende stappen zijn 37 ° C / 5% CO₂ / 80% luchtvochtigheid</li><li> Bestralen stimulator PBMC (3,3 Gy) en toevoegen aan een T-25 50cm³ Celkweek kolf met een gas-permeabel cap. Etiket de kolf "Bulk alloanergizing co-cultuur".</li><li> Voeg 10 ml van de reagerende PBMC (bij 1 miljoen / ml in CM) in de kolf.</li><li> Voeg een verdere 100mg elk van de anti-B7.1 en B7.2 anti-antilichamen en vóór meng aan het plaatsen van de kolf rechtop in een incubator voor 72 uur</li></ol><p class="jove_title"> 3. Instellen van de Bulk Controle Co-cultuur</p><ol><li> Plaats 10 miljoen stimulator PBMC (bij 1 miljoen / ml) in een 15 ml Falcon buis.</li><li> Bestralen 10 miljoen stimulator PBMC (3,3 Gy). En toevoegen aan een 50cm³ Celcultuur fles. Label "Bulk controle co-cultuur".</li><li> Voeg 10 ml van de reagerende PBMC op 1 miljoen / ml in CM aan de kolf en voorafgaand meng aan het plaatsen van de kolf rechtop in een incubator voor 72 uur.</li></ol><p class="jove_title"> 4. Instellen van de primaire gemengde lymfocyt Reactie (MLR) naar de werkzaamheid van co-stimulerende blokkade Measure</p><ol><li> De werkzaamheid van costimulatoire blokkade wordt gemeten in een primaire MLR die is opgezet met behulp van PBMC van de bulk alloanergizing en controle co-culturen</li><li> De primaire MLR is ingesteld op dezelfde dag dat de bulk culturen zijn ingesteld</li><li> Eerste label een U-bodem 96 wells-plaat "Primaire MLR" voor elk van de drie tijdstippen te meten (Dag 4, 5 en 6 na de borden zijn ingesteld).</li><li> Schenk 5 ml van elk van de bulk-controle en alloanergizing co-culturen in 15 ml Falcon buizen.</li><li> Pipetteer 200 ml celsuspensie van elke Falcon pijp in drievoud putjes op elk bord. Label deze putten "no costimulatoire blokkade (CSB)" voor de cellen uit de totale controle co-culturen en "CSB" voor de cellen van de bulk alloanergizing co-culturen</li><li> Voeg 200 ml CM tot 6 putten op elke plaat als negatieve controles. 200mL PBS wordt toegevoegd aan alle lege putten om de verdamping te verminderen. Plaats platen in de incubator.</li></ol><p class="jove_title"> 5. Instellen van de secundaire MLR om de werkzaamheid van Alloanergization Measure</p><ol><li> 72 uur na het opzetten van de bulk co-culturen, zijn resterende alloresponses in alloanergized PBMC's gemeten in een secundaire MLR. In de secundaire MLR, PBMC van zowel de bulk alloanergizing co-cultuur en de bulk controle co-cultuur worden gewassen en opnieuw gestimuleerd met bestraalde PBMC allostimulator</li><li> Voor het instellen van de secundaire MLR label een U-bodem 96 wells-plaat "Secundaire MLR" voor elk van de drie tijdstippen te meten (Dag 3, 5 en 7 na instellen).</li><li> Verwijder 5 ml van elk van de bulk-controle en alloanergizing co-culturen, transfer naar 15 ml Falcon buizen en centrifugeer gedurende 5-10 minuten op 2000 zorgvuldig rpm.Aspirate het supernatans, verstoren de korrel, voeg 10 ml van CM en weer centrifuge de cellen. Herhaal deze wasstap.</li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml van de CM. Tel de levensvatbare cellen met behulp van trypan Blue kleuring, en pas de cel concentratie tot 1 miljoen levensvatbare responder cellen / ml.</li><li> Pipetteer 100 ml celsuspensie van elke Falcon buis in drievoud putten van elk bord. Label deze putten "First Party (FP) allorestimulation"</li><li> Pipetteer 100 ml celsuspensie van elke Falcon buis in een verdere drie putten op elk bord en label deze bronnen "CD3/28 stimulatie"</li><li> Om stimulator cellen voor te bereiden op de secundaire MLR, isoleren PBMC van vers bloed (of reanimeren gecryopreserveerd PBMC) van dezelfde gezonde donor gebruikt om de eerste partij stimulator PBMC's te leveren in de alloanergizing en controle culturen.</li><li> Hang PBMC van de FP donor bij een concentratie van 1 miljoen / ml en bestralen (3.3Gy)</li><li> Voeg 100 ml van bestraalde stimulator cellen om waterputten met het label "FP allorestimulation"</li><li> Voor de positieve controles, voeg 1 ml van elk van CD3 en CD28 monoklonale antilichamen en 98mL van de CM te putten met het label "CD3/28 stimulatie". Voeg 200 ml CM tot 6 putten op elke plaat als een negatieve controle en 200 ml PBS putten te legen. Leg de platen in de incubator.</li></ol><p class="jove_title"> 6. Het meten van de specificiteit van Alloanergization</p><ol><li> De specificiteit van alloanergization wordt bepaald door het vergelijken van de proliferatie van de reagerende cellen van de voltooide alloanergizing en controle co-culturen na stimulatie met bestraalde PBMC verkregen van een "derde partij" gezonde donor (bv. een andere donor naar de eerste partij) in een secundaire MLR.</li><li> Label drie platen met 96 putjes "Secundaire MLR Specificiteit" Dag 3, 5 en 7.</li><li> Verwijder 5 ml van elk van de bulk-controle en alloanergizing co-culturen over te dragen aan 15 ml Falcon buizen en centrifugeer gedurende 5-10 minuten bij 2000 rpm. Zorgvuldig aspireren het supernatans, verstoren de korrel, voeg 10 ml van CM en weer centrifuge de cellen. Herhaal deze wasstap.</li><li> Resuspendeer de cellen in 1 ml van de CM. tellen met behulp van trypan Blue kleuring, en pas de cel concentratie tot 1 miljoen levensvatbare responder cellen / ml.</li><li> Om van derden stimulator cellen voor te bereiden op de secundaire MLR, isoleren PBMC van vers bloed (of reanimeren gecryopreserveerd PBMC) van een nieuwe gezonde donor. Pipetteer 100 ml celsuspensie van elke Falcon buis in drievoud putten van elk bord. Label deze putten "TP allostimulation"</li><li> Hang PBMC van een TP donor op 1 miljoen / ml en bestralen (3,3 Gy)</li><li> Voeg 200 ml bestraald TP stimulator cellen te putten met het label "TP allostimulation"</li><li> De specificiteit van alloanergization kan ook worden bepaald door het vergelijken van de proliferatie van de reagerende cellen van de voltooide alloanergizing en controle co-culturen na stimulatie met een besmettelijke pathogeen, zoals CMV. Voor deze stap is het essentieel om responder PBMC gebruiken van donoren met eerder aangetoond proliferatieve reacties aan CMV lysaat.</li><li> Label drie platen met 96 putjes "Secundaire MLR CMV" Dag 3, 5 en 7.</li><li> Ter voorbereiding van de responder cellen voor de secundaire MLR om CMV reacties te meten, transfer 5 ml van elk van de bulk-controle en alloanergizing co-culturen tot 15 ml buizen en wassen, tellen en bij 1 miljoen cellen / ml opnieuw in suspensie in CM zoals eerder beschreven . Pipetteer 100 ml celsuspensie van elke Falcon pijp in een drie putten op elk bord.</li><li> Voeg 0,1 mL van CMV-lysaat in 100ul CM te putten</li><li> Voeg 200 ml van CM tot 6 putten op alle plaat als een negatieve controle en voeg 200 ml PBS putten te legen. Leg de platen in de incubator.</li></ol><p class="jove_title"> 7. Het meten van proliferatie in de primaire en secundaire MWR</p><ol><li> Responder celproliferatie wordt gemeten door thymidine assay in de primaire en secundaire MWR. Proliferatie wordt gemeten op dag 4, 5 en 6 na de primaire MLR platen opgezet en op dag 3, 5 en 7 na de secundaire MLR platen opgezet.</li><li> 1mCi van getritieerd thymidine wordt toegevoegd aan de wells 16 uur vóór het oogsten</li><li> Na de toevoeging van getritieerd thymidine, is de plaat geïncubeerd gedurende een uur further16 vervolgens geoogst op een filter mat met behulp van een Tomtec harvester (of iets dergelijks). De lucht drogen van de filtermat een uur plaats dan in een monster zak, voeg 5 ml scintillatievloeistof en afdichting. Lees de plaat in een Wallac Micro beta scintillatieteller of iets dergelijks.</li></ol><p class="jove_title"> 8. Het berekenen van de werkzaamheid van co-stimulerende blokkade in de primaire MLR</p><ol><li> Het percentage inhibitie (PI) van de primaire alloresponses wordt berekend als 100 x [gemiddelde cpm in allostimulation putten (bulk alloanergy co-cultuur PBMC) – gemiddelde cpm in allostimulation putten (bulk controle co-cultuur PBMC)}<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq1.jpg" alt="Equation 1" ></ol><p class="jove_title"> 9. Het berekenen van de werkzaamheid van Alloanergization in de secundaire MLR</p><p class="jove_content"> De PI van het voortgezet alloresponses wordt berekend als<br /><img src="files/ftp_upload/2673/2673eq2.jpg" alt="Equation 2" ><p class="jove_title"> 10. De berekening van de specificiteit van Alloanergization in de secundaire MLR</p><ol><li> Na restimulatie van cellen met CD3 en CD28, kan TP allostimulators of CMV-antigeen, de PI van de antwoorden op deze stimuli ook worden berekend met behulp van deze formule. Dit geeft een maat voor de specificiteit van de alloanergization proces</li></ol><p class="jove_title"> 11. Het genereren van Alloanergized Donor PBMC voor klinisch gebruik na allogene hematopoietische stamceltransplantatie (HSCT)</p><ol><li> Alloanergized donor PBMC kan worden gegenereerd voor klinisch gebruik na HLA-mismatch allogene HSCT gebruik van het protocol hierboven geschetste</li><li> Bij het genereren van cellen voor klinisch gebruik, responder PBMC worden verkregen uit de HSCT donor en stimulator PBMC van de HSCT ontvanger voorafgaand aan de transplantatie.</li><li> Bij het genereren van PBMC voor klinisch gebruik, alle stappen worden uitgevoerd onder Good Manufacturing Process voorwaarden in geaccrediteerde stamcellen verwerkingsinstallaties.</li><li> Extra kwaliteitscontrole testen worden uitgevoerd met inbegrip van endotoxine testen en Gramkleuring en cultuur om de veiligheid te voldoen voorafgaand aan de release van de cellen voor klinisch gebruik</li></ol><p class="jove_title"> 12. Representatieve resultaten</p><p class="jove_content"> Met behulp van HLA-mismatch stimulator en responder PBMC, de aanwezigheid van costimulatoire blokkade in de primaire MLR vermindert betekenen alloproliferation van de reagerende PBMC op dag 5 tot ongeveer 30% (+ / – 10%, gemiddelde + / – standaard deviatie) van die gezien in controle primaire MLR in de afwezigheid van costimulatoire blokkade. Dit komt overeen met een gemiddelde remming van primaire alloproliferation van rond de 70% (+ / – 10%) bij D5,<strong> Figuur 1 A en B</strong>.</p><p class="jove_content"> In de secundaire MLR op dag 5, FP alloproliferation van alloanergized PBMC is gewoonlijk 10-15% (+ / – 10%) van dat van controle PBMC gelijk aan een gemiddelde remming van de proliferatie van 85-90% (+ / – 10 %),<strong> Figuur 2A en B</strong>. Dit toont aan dat alloanergized PBMC zijn hyporesponsieve tot FP allostimulators.</p><p class="jove_content"> In tegenstelling alloanergized PBMC meestal behouden 70-100% van hun verspreiding te mitogenen (CD3/CD28 antistoffen), TP allostimulators en CMV lysaat (in CMV-reactief donoren). Dit toont aan dat hyporesponsieve van alloanergized PBMC is specifiek voor FP allo-antigenen.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong> Figuur 1. A.</strong> Proliferatie (bepaald door thymidine) in een primaire gemengde lymfocyt reactie met behulp van HLA-mismatch stimulator en responder perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) in de afwezigheid of de aanwezigheid van costimulatoire blokkade met behulp van gehumaniseerd monoklonaal anti-B7.1 en B7.2- antilichamen. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde (+ /-SD) voor 8 representatieve experimenten met behulp van een unieke stimulator-responder paren.<strong> B</strong>. Percentage remming van alloproliferation in het primair MWR uitgevoerd in de aanwezigheid van costimulatoire blokkade met behulp van gehumaniseerd monoklonaal anti-B7.1 en B7.2-antilichamen. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde (+ /-SD) voor dezelfde acht unieke stimulator-responder paren afgebeeld in figuur 1A.</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2673/2673fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong> Figuur 2. A.</strong> Proliferatie (bepaald door thymidine) in het voortgezet MWR waar responder PBMC van primaire MWR uitgevoerd in de afwezigheid (controle PBMC) of de aanwezigheid van costimulatoire blokkade (alloanergized PBMC) zijn opnieuw gestimuleerd met bestraalde eerste partij stimulators. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde (+ /-SD) voor de 8 unieke stimulator-responder paren afgebeeld in figuur 1.<strong> B</strong>. Percentage remming van de First Party alloproliferation in het voortgezet MWR waar responder PBMC van primaire MWR uitgevoerd in de afwezigheid (controle PBMC) of de aanwezigheid van costimulatoire blokkade (alloanergized PBMC) zijn opnieuw gestimuleerd met bestraalde eerste partij stimulators. Resultaten zijn weergegeven als gemiddelde (+ /-SD) voor de 8 unieke stimulator-responder paren afgebeeld in figuur 1 en figuur 2A.</p>