Modificado embrionárias de camundongos com células-tronco Ensaio baseado para quantificar a eficiência de indução cardiogênico

1. Corpo formação embrionária (EB), utilizando fundo 96-redonda bem placas de microtitulação Cultivar células TE de camundongos em placas de 10 centímetros de cultura de células com o mouse médio de células ES suplementado com LIF. Quando as células ES estão prontos para uso (geralmente na confluência 50-70%), remova a mídia ES e lavar as células uma vez com 5ml de PBS estéril. Adicionar 2 ml de tripsina 0,05% / EDTA para cada placa e incubar as placas a 37 ° C por 3 ~ 5 minutos, Quench tripsina EDTA com 3 ml de mídia ES. Transferência de células para tubos falcon de 50ml e giram a 1000 rpm por 3 minutos. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet celular com uma quantidade desejada de EB mídia. Conte o número de células e diluir as células a 5 x10 3 células / ml no EB mídia. Use pipeta multicanal para adicionar 100μl de EB mídia contendo células em cada poço de 96 – round placas de microtitulação. Lugar 96 – rodada placas de microtitulação bem em uma incubadora. 2. Identificação de janelas de tempo crítico da via de sinalização chave (s) para cardiogenesis Adicionar moduladores de vias de sinalização específica e de controle do veículo em cada poço de placas de microtitulação de 96 poços contendo células-tronco embrionárias em momentos diversos, tais como o dia 0, dia 1, dia 2, dia 3 e dia 4, etc Metade dos poços em cada 96 bem-placa (48 poços) são usados ​​para cada ponto de hora de início do tratamento. Lavar a moduladores mudando media EB para cada 48 poços em diferentes pontos de tempo de parada. Por exemplo, para obter dois dias de tratamento para as células ES a partir de dia 0, lavar a moduladores no dia 2. Para qualquer tratamento mais de 48 horas, a mudança de mídia EB suplementado com moduladores fresco a cada dois dias até que os pontos de tempo desejado parar. Examine contração EB sob um microscópio após o dia 7. Pontuação dos poços com a contratação EBs como positivos para obter porcentagens de contratação para cada EBs cursos tempo diferente de tratamento. Os pontos momento crítico para cardiogenesis ES são os prazos em que continha o maior percentual de contratação EBs tratados por moduladores de sinalização quando comparado com o controle do veículo. 3. Verificação de janelas de tempo de sinalização para cardiogenesis em EBs feita a partir de gotas de suspensão Prepare placas de Petri, adicionando com 3-4 ml de PBS para evitar a evaporação. Siga os passos 1,1 ~ 1,5 para preparar células-tronco embrionárias em 2.5×10 4 células / ml densidade celular final. Despeje a mistura de células bacterianas em prato de fácil acesso. Usando pipeta multicanal, adicione 20 gotas mL (contendo cerca de 500 células) para tampas invertidas. Não permita que as gotas individuais ao toque. Geralmente uma tampa pode caber até 80 gotas. Vire a tampa para trás sobre o prato contendo PBS. Incubar por 24 horas ou 48 horas para permitir a formação EB em uma incubadora. Lavar EB formado a partir de gotas de suspensão de cada tampa com 3 ml de mídia e piscina EB 2 tampas de EBs a nova placa de Petri. Adicionar mídia EB para um volume total de 10ml. Transferência EBs em suspensão para 0,2% de gelatina revestido de 6 placas bem no dia 4. Em geral 30 EBs são transferidos para cada poço. Adicionar mídia EB para obter o volume de 2 ml final para cada poço. Incubar moduladores de sinalização no período de tempo identificados a partir de 96 poços experimentos prato. Observe a contração EB sob microscópio após o dia 7 e cardiogenesis pode ser ainda caracterizada por RT-PCR de positividade, e outros, se necessário.