1. Biorreator Assembléia Figura detalhada (s) do projeto de biorreatores e montagem tanto para decelularização e cultura são fornecidos nas Figuras 1 e 2, respectivamente. Todos os componentes devem ser esterilizados antes da montagem do biorreator. Os seguintes pontos específicos são observados: CONEXÕES: A cânula arterial é composto por um encaixe luer-lock ligado a um Y-divisor por um pequeno segmento de tubulação. O conector luer-lock está ligado ao tubo de perfusão, eo segmento do Y que não é suturada com a artéria pulmonar é conectado a uma válvula unidirecional. A válvula unidirecional é orientada de modo fluido que pode ser retirado para a tubulação (na direção oposta, como perfusão), mas durante toda a perfusão dos órgãos médio flui para o pulmão. A cânula traqueal também consiste de um conector luer-lock ligado a um Y-divisor com tubulação. O luer-lock se conecta a um circuito de respiração entre o reservatório de traquéia e da câmara principal. O segmento do conector Y que não é suturado à traquéia também é conectado a uma válvula unidirecional. A válvula unidirecional é orientada da mesma forma como a cânula arterial. FUNÇÕES: As válvulas de sentido único nas cânulas arterial e traqueais são utilizados para limpar as bolhas de ar na tubulação, permitindo a inversão do fluxo na tubulação e, portanto, permitir bolhas de ar a ser removido. O "loop respiração" inclui duas válvulas de sentido único, posicionado como meio que segue um caminho diferente dentro e fora do pulmão. Uma descrição mais detalhada desta funcionalidade é fornecida em uma publicação prévia do nosso 2 laboratório. Perfusão vascular é fornecido utilizando uma bomba de rolete. Medium é perfundido na artéria pulmonar através da cânula em anexo, flui através da vasculatura pulmonar e as veias pulmonares diretamente no biorreator principal, onde meio é elaborado para perfusão. 2. Colheita de órgãos Euthanize adultos (3-6 meses de idade) ratos Fischer 344 por overdose de sódio pentobarbital, de acordo com diretrizes estabelecidas pela American Veterinary Medical Association (60 IP mg / kg). Nota: a solução pentobarbital inclui heparina de 100 unidades / ml para a anticoagulação. Spray ou limpar o peito e abdômen com álcool 70%. Abrir a cavidade torácica, expondo o coração e os pulmões, tomando cuidado para não danificar os pulmões. Fazer com cuidado uma pequena janela através do diafragma na cavidade torácica, causando os pulmões para retrair e expanda esta incisão horizontal para expor as bases dos pulmões. Faça duas incisões verticalmente através das costelas, e retrair a caixa torácica para expor o coração e os pulmões. Preparar um sistema de perfusão gravidade, ou seja, utilizando uma seringa com êmbolo removido, uma torneira de 3 vias, e ~ 20 centímetros de tubo com um 1.5inch, agulha 21 gauge. Manter a seringa em ~ 20 centímetros acima do animal usando um suporte de anel. Assegurar que todo o ar é retirado o tubo de perfusão. Corte o átrio direito para drenar sangue, impedindo-a de volta para os pulmões. Corte o átrio esquerdo para permitir a drenagem fácil de sangue e perfusato dos pulmões também pode ser útil, mas não é necessário. Inserir a agulha na base do ventrículo direito e abra a torneira para perfundir os pulmões com uma solução de heparina e nitroprussiato de sódio (50U/ml e 1ug/ml, respectivamente) em PBS. Confirmar que a artéria pulmonar se enche com líquido de perfusão, e que o sangue é clearing dos pulmões. Se necessário, encher a seringa com líquido de perfusão adicional. Normalmente apenas 10ml ~ é necessária. Continue perfusão até que os pulmões são claras de sangue, então pare de perfusão. Dissecar o livre traquéia, até no pescoço, tanto quanto possível. Garantir a traquéia é separado do esôfago. Dissecar todas as conexões restantes para o coração, pulmões e traquéia, e remover em bloco. Usando uma tesoura bisturi ou afiada, corte o ápice do coração, expondo os ventrículos direito e esquerdo. Canular o tronco pulmonar através do ventrículo direito, e sutura no local. Remova qualquer excesso de tecido ventricular esquerda. Canular a traquéia e sutura no local. Certifique-se que ambas as cânulas traqueais e pulmonares arterial estão posicionados de tal forma que não há força de torção na traqueia, pulmões ou grandes vasos (Figura 1). Garantir que não há bolhas de ar na cânula arterial, uma vez que as bolhas de ar presas no sistema pode impedir o fluxo constante de através do órgão. Em alguns casos, uma bolha de ar pode parar completamente flow.To fluido conseguir isso, coloque o bloco do coração / pulmão em um frasco contendo PBS. Use uma seringa com agulha para injetar uma pequena quantidade de PBS para a cânula de coração para expulsar as bolhas. Lavagem das vias respiratórias com PBS 4-5 vezes, para remover o ar, tanto quanto possível do pulmão. Após o passo lavagems são completos, inflar o pulmão com PBS contendo nitroprussiato de sódio (SNP) em 1ug/ml. Coloque uma rolha na cânula traqueal, para que a solução permanece no pulmão. Permitir que o pulmão para incubar por até 30 minutos, a mesma solução flui através da vasculatura através da artéria pulmonar, para permitir a vasodilatação. Conectar coração / pulmões para uma tampa de biorreator utilizando as conexões luer-lock ligado ao cânulas em forma de Y, descrito em "Assembléia biorreator" acima. (Figura 1). 3. Decelularização órgão Conecte a tampa (com pulmões ligados) aos aparelhos decelularização (Figura 1). A cânula da artéria pulmonar deve ligar para a linha de perfusão, ea cânula traqueal deve free float. Assegurar que todas as linhas são claras de ar. Como descrito acima, de ar nas linhas podem ser uma fonte de decelularização pobres, impedindo o fluxo de fluido decllularization. Ar preso no sistema pode também persistem no tempo da cultura, quando pode ter um impacto negativo sobre a sobrevivência da célula 3. Inflar o pulmão com PBS / SNP até os pulmões estão cheios, mas não exageradas. Imediatamente tampa da cânula traqueal, para que o pulmão permanece inflado. Perfundir pulmão com PBS / SNP por pelo menos 15 min a ~ 15 mmHg (20cm H 2 O de pressão). Depois de 15min ou mais, retire a tampa da cânula traqueal para permitir que o pulmão esvaziar. Continue a perfusão com PBS / SNP por 30min. Se necessário, recarga PBS / SNP para garantir a pressão de perfusão é mantida em 10-15 mmHg. Começar a perfusão com solução decelularização (CHAPS 8mm, 1M NaCl, 25mM EDTA em 1X PBS). Tome cuidado para garantir que todas as linhas são claras de ar. Um sistema de vácuo pode ser útil para fornecer sucção. Perfundir com solução decelularização até 500ml de solução tem perfundidos através do pulmão. Pressão ideal é <15 mmHg (~ 20 cm H 2 O). Isso normalmente requer 2,5 horas. Taxas de fluxo são normalmente muito lento (0.2-0.5ml/minute) inicialmente, e aumentar rapidamente durante a segunda hora para cerca de 1ml/minute ou superior. Periodicamente, remover o líquido decelularização usado de biorreator, garantindo bastante líquido continua a apoiar o pulmão e cânula traqueal. 4. Órgão de lavagem e esterilização Transferência de pulmão e biorreator para uma capa de cultura de tecidos. Começar a lavagem com PBS estéril, removendo o frasco de 500ml que continha o líquido decelularização e substituir por um frasco estéril contendo até 1L de PBS estéril. Use sucção a vácuo para garantir linhas são claras de ar. Perfundir PBS através da vasculatura de 15/10 mmHg, da mesma maneira como para decelularização. Periodicamente, remova os resíduos de PBS biorreator e substituir e / ou encher o frasco com PBS fresco, PBS estéril. É aconselhável o uso de técnica estéril. Continuar a enxaguar até pelo menos 2,5 L de PBS estéril têm perfundidos no pulmão. Transferência de pulmão para um novo sistema de biorreator, estéril, contendo PBS fresco. Assegurar que tanto o ciclo inteiro de perfusão e as linhas das vias aéreas todo são preenchidos com fluido. Todas as etapas subseqüentes será usar uma bomba pulsátil para perfundir pulmões na 5ml/min. Esterilizar o cadafalso, quer através de perfusão durante a noite com PBS + 10% FBS + 10% de solução caneta strep ou por 3 horas com 0,1% de ácido peracético em PBS. Este último vai exigir a lavagem do pulmão com 3 mudanças de 250ml PBS durante várias horas para remover o ácido residual. Para cada lavagem, o pulmão deve ser ventilado, bem como perfundidos para garantir que todas as partes do tecido fiquem completamente lavados. Transferência do pulmão para a 37 ° C incubadora e perfundir com PBS que tem 10% de SFB e 10% de penicilina / estreptomicina por ~ 1h ou até que a temperatura é equilibrado, em preparação para o tratamento benzonase. Tratar de pulmão com benzonase para remover DNA remanescente: Aquecer o tampão benzonase (ver Tabela de Reagentes) a 37 ° C. Para cada pulmão, encha uma seringa de 10 ml com tampão benzonase apenas e uma seringa de 10 ml com benzonase 90U/ml no buffer. Parar perfusão do pulmão. Inflar as vias aéreas com tampão benzonase. Permitir que o pulmão esvaziar (por ~ 1 minuto). Então, encha o pulmão com a solução benzonase. Durante a inflação com tampão benzonase & benzonase, para tentar evitar qualquer injeção de ar no pulmão. Permitir que o pulmão se sentar sem perfusão ou ventilação a 37 ° C durante 1 hora após inflável com benzonase. Retomar a perfusão com o PBS + 10% FBS, 10% de penicilina / estreptomicina que já está no biorreator, e continuam durante a noite. No dia seguinte, o pulmão pode ser armazenado a 4 ° C (por até 3 meses) ou preparados para a semeadura de células. Para preparar o andaime para repovoamento celular, substituir o PBS / SBF / benzonase solução com ~ 250ml de meio de cultura. Perfundir por pelo menos uma hora antes de as células são introduzidas, umand substituir com meio de cultura fresco directamente antes de as células semeadura. 5. Recellularization A escolha da fonte de células para reseeding órgão é deixada para os investigadores individuais. Muitas fontes de células podem ser utilizadas, incluindo as populações disponíveis comercialmente, recém-isoladas neonatal ou fetal células pulmonares, células-tronco embrionárias, ou fontes de células disponíveis comercialmente. Protocolos de isolamento específico para estas populações de células pode ser encontrada em outros lugares 4,5,6. Aqui, nós fornecemos instruções sobre como semente de ambas as populações de células endoteliais e epiteliais. Semeadura endotelial: Prepare uma suspensão de população de células endoteliais desejado, em meio de cultura apropriado. Suspensão de células do filtro através de um filtro para remover células 40um aglomerados de células. A semeadura típico endotelial em nosso laboratório poderia utilizar cerca de 30 milhões de pulmão de ratos células endoteliais microvasculares em 60ml de meio de cultura. Dispense suspensão de células em um pequeno reservatório temporariamente incorporadas ao circuito de perfusão do biorreator (Figura 2). Garantir que a tubulação a partir deste reservatório e do laço de perfusão inteiro é claro de bolhas de ar. Infundir células na artéria pulmonar em 3ml/min usando uma bomba de rolete. Após a infusão de células, continue perfusão com meio recirculado do biorreator principal na taxa desejada. Em uma base diária, garantir que o tubo de perfusão é claro de bolhas de ar. Médio deve ser substituído por meio fresco regularmente, o que muitas vezes é feito a cada 3-4 dias. Semeadura epiteliais: Prepare uma suspensão de células da população de células epiteliais desejado. Em nosso laboratório, isso normalmente é composto por cerca de 5-10 células de rato neonatal pulmonar. Filtrar a população através de peneira de células 40um e suspender em 15ml de meio de cultura em uma seringa. Encher o reservatório das vias aéreas com 80ml de meio de cultura. Coloque o biorreator de 37 ° C a cultura de tecidos incubadora, e ligar a bomba de seringa para ventilação. Assegurar que todas as linhas de ventilação são claras de ar. Semente das células para o pulmão através da injeção de 15ml de suspensão celular como um bolus único na cânula traqueal. Começar imediatamente uma respiração única e lenta usando a bomba de seringa. Esta respiração é administrado pela retirada de 60ml de ar do biorreator principal no 3ml/minute, portanto, com duração de aproximadamente 20 minutos. Garantir os filtros de ar no biorreator principais são tampados imediatamente após a injeção da suspensão celular e antes de começar a respiração lenta. Permitir que os pulmões para sentar-se estaticamente por cerca de 18hrs, e então começar a perfusão vascular lento (aproximadamente 0,5 ml / min). 6. Cultura de órgãos Embora os detalhes da perfusão e ventilação varia de acordo com desenho experimental, os seguintes pontos são observados: Durante a cultura endotelial, a perfusão é tipicamente realizada em 1-3 ml / min usando uma bomba de rolete. Durante a cultura epitelial, a ventilação é geralmente fornecida a uma taxa contínua de uma respiração por minuto usando uma bomba de seringa. Retirada de 5 10ml de ar do biorreator principal é normalmente necessário para efetuar a ventilação pulmonar em um volume normal de maré. Devido à necessidade de manter o hermético biorreator durante a ventilação, a ventilação deve ser pausada diária e do ar na câmara principal deve ser trocada. Todo o ar no sistema é ar ambiente, que é aproximadamente 21% de oxigênio por pressão parcial. A retirada 5 10ml de ar do biorreator (que induz uma inspiração 5-10ml de fluido pelo pulmão) é baseado no tamanho do pulmão e quantos lobos estão sendo cultivados (lobos pode ser amarrado para análise, enquanto o lobos restantes continuam na cultura). A quantidade de ar retirado pela bomba de seringa é escolhido para aproximar o "volume corrente" do pulmão cultivadas. Médio deve ser alterado aproximadamente a cada 3-4 dias durante a cultura. Durante a co-cultura do epitélio e endotélio, as experiências em nossa semente de laboratório primeiro tipicamente o epitélio por 4-8 dias, durante os quais o da engenharia de tecidos é ventilado. O endotélio é então semeado através de perfusão, após o qual o tecido é tanto perfundidos e ventilado. 7. Resultados representativos: Decelularização Quando o protocolo é realizado corretamente, os pulmões recém-extraídos deve segurar o ar, sem vazamento. Inflando-os com ar ao mesmo tempo submerso em líquido pode verificar isso – não deve haver quaisquer bolhas, indicando vazamento de ar. A decelularização subseqüentes devem permitir ~ 500ml de líquido decelularização a fluir através dos pulmões ao longo de 2,5 – 3 horas a 37 ° C, e PBS deve finalmente ser capaz de fluir através dos pulmões em cerca de 10 ml / min (em ~ 15 mm Hg de pressão hidrostática) no final da lavagem. Após o tratamento com 0,1% de ácido peracético e benzonase, os pulmões podem ser armazenados a 4 ° C por até 3 meses, e ainda permanecem adequados para recellularization. A matriz extracelular decelularizado finais devem ser completamente desprovido de materiais celulares, e manter as características brutas, microscópicos e ultra-estruturais de pulmão nativo. Decelularização insuficiente ou de lavagem podem resultar em remanescente DNA "degola" para o cadafalso, que podem ser visualizados com um padrão hematoxilina e eosina (veja a Figura 3 para comparação). Repovoamento da matriz acelular e cultura de tecido pulmonar Se as células são recém isoladas de sete dias de idade os filhotes de rato neonatal, conforme descrito no suplemento on-line que acompanha o trabalho de Petersen e colaboradores 4, pode-se esperar um rendimento de células de 120-150 milhões de células por ninhada de 10 filhotes (pouco mais de 10 milhões células por recém-nascido). Condições ideais para a semeadura de células e cultura subseqüente do pulmão no biorreator deve render bem distribuídos em todas as células cinco lobos do pulmão, e deve fornecer uma cobertura de aproximadamente 70% da matriz extracelular andaime (Figura 3). A população de células cultivadas será positivo para os principais marcadores de células respiratórias, como a secretora pró-proteína C (SPC), proteína secretora Clara celular (CCSP), e aquaporina-5 (AQP), em ordem de abundância relativa (Figura 4). Figura 1. Posições Cânulas e biorreator decelularização Figura 2. Biorreator utilizado para plantio e cultura de tecido pulmonar de engenharia Figura 3. Histologia de natal, decelularizado e repovoada pulmão Figura 4. Coloração de imunofluorescência para os marcadores de pulmão chave