iCLIP - 全转录组，蛋白质与RNA相互作用的映射与个别核苷酸分辨率

1。 UV交联的组织培养细胞取出介质，并加入6毫升冰冷的PBS细胞生长在一个10厘米的板（足够的三个实验）。 取下盖板，将在冰上。 150兆焦耳/厘米2在254 nm，照射一次。 收获的细胞与细胞起苗刮。 将2毫升细胞悬液，每3微管。最高时速为10秒旋转4 ° C至沉淀细胞，然后去除上清液。 管理单元冻结在-80 ° C，直到使用干冰和存储单元颗粒。 2。珠准备加入100μL蛋白一个磁珠每到一个新的微管实验（DYNAL 100.02）（使用鼠标或山羊抗体蛋白G磁珠）。 洗珠裂解液（50毫米的Tris – HCl，pH值7.4; 100毫米氯化钠，1％NP – 40，0.1％SDS，0.5％去氧胆酸钠，1 / 100的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒第三，Calbiochem）的2倍。 在2-10微克抗体100μL裂解液重悬珠。 在室温为30-60分钟旋转管。 900μL裂解液洗3倍，并准备继续执行步骤4.1离开，直到在最后一次洗涤。 3。细胞裂解和RNA的消化部分 1毫升裂解液转移到1.5 ml的微管，重悬细胞沉淀。 我核糖核酸（Ambion公司，AM2295）准备一个1 / 500稀释。添加10μL核糖核酸我稀释以及2μL涡轮的DNA酶的细胞裂解液（核糖核酸我1 / 500稀释低RNase的1 / 50稀释用于库准备; [高核糖核酸酶抗体的特异性是必要的控制） 。 孵育整整3分钟，在37 ° C在1100 rpm时的晃动，样品。立即传送到冰。 旋转4 ° C和20分钟的22000克，以明确的裂解。仔细收集上清（留约50μL裂解液沉淀）。 4。免疫沉淀删除从珠（步骤2.5）缓冲液洗，再加入细胞裂解液（步骤3.4）。 旋转2 h后的样品在4 ° C。 弃上清，洗珠900μL高盐缓冲液（50毫米的Tris -盐酸，pH值7.4; 1 M氯化钠; 1毫米EDTA，1％NP – 40，0.1％SDS，0.5％去氧胆酸钠）2X。 洗2倍，而与900μL洗涤缓冲液（20毫米的Tris – HCl，pH值7.4; 10毫米MgCl 2的 0.2％Tween – 20的）。 5。去磷酸化的RNA的3'ends 弃上清，重悬在20μLPNK混合珠（15μl水; 4μL5倍PNK pH值6.5缓冲液[350mMTris盐酸，pH值6.5; 50mMMgCl 2 25mMdithiothreitol]; 0.5μLPNK酶0.5μLRNasin [Promega公司]） 。 20分钟在37 ° C。 加入500μl洗涤缓冲液，并用高盐缓冲液1X。 洗涤缓冲液洗2倍。 6。链接器结扎RNA 3'末端小心取出上清液，重悬在20μL结扎混合珠（9μl水; 4μL4X连接缓冲液[200 mMTris -盐酸;40米MM GCL 2; 40毫米二硫苏糖醇]; 1μLRNA连接酶0.5μL，RNasin [NEB]; Promega公司] 1.5μL预adenylated连接器L3 [20微米; 4μLPEG400 [81170，Sigma公司）。 过夜孵育在16 ° C。 加入500μl洗涤缓冲液，然后用1毫升高盐缓冲的2倍。 洗用1 ml缓冲液洗2倍和1毫升洗第二次离开。 7。 RNA的5'末端标记取出上清液，重悬在8μL热PNK混合珠（0.4μLPNK [NEB]; 0.8μL32个P -γ- ATP的0.8μL10X PNK缓冲[NEB]; 6μl水）。 5分钟在37 ° C。 取出热PNK组合和20μL1X Nupage样缓冲液（Invitrogen公司）重悬珠。 在thermomixer孵育70 ° C时为10分钟。 立即将一块磁铁沉淀空珠和负载上清液凝胶（见第8步）。 8。 SDS – PAGE和膜内转印负载的样品在4-12％NuPAGE双三凝胶（Invitrogen公司）根据制造商的指示。使用1X MOPS运行缓冲液（Invitrogen）的0.5升。还可以加载5μL预染蛋白大小的标记（例如页统治者加，Fermentas公司，SM1811）。 运行50分钟的凝胶在180 V。 取出凝胶前和丢弃的固体废物（含免费放射性ATP的）。 蛋白- RNA复合物，从凝胶转移到硝酸纤维素膜，使用NOVEX调湿装置，根据制造商的说明（Invitrogen公司，转让1小时在30 V）。 转让后，PBS缓冲液冲洗膜，然后在保鲜膜包装，并到富士胶片暴露于-80 ° C（地方一个荧光贴纸膜后ALIGN T他的膜和膜30分钟，1小时，在夜间执行曝光）。 9。 RNA分离从低核糖核酸作为面膜的步骤8.5中使用的放射自显影的实验分离蛋白- RNA复合物。这片膜切成若干小片，放入1.5 ml的微管。 添加200μLPK缓冲区（100毫米的Tris – HCl pH 7.4的50 mM氯化钠10毫米EDTA）和10μL蛋白酶K（罗氏，03115828001）膜件。孵育20分钟1100转的摇晃，在37 ° C。 PKurea缓冲区（100毫米的Tris – HCl pH 7.4的50 mM氯化钠10毫米EDTA; 7 M尿素）加入200μL和20分钟在37 ° C。 收集解决方案，并添加400μLRNA的酚/氯仿（Ambion公司，9722）2毫升锁相凝胶重型管（713-2536，VWR）。 孵育5分钟在30 ° C，在1100 rpm时的晃动。 13000 RPM在室温5分钟旋转分离的阶段。 转移到一个新的管水层（要小心，不要触摸移液器凝胶）。添加0.5μLglycoblue（Ambion公司，9510）和40μL3 M醋酸钠pH值5.5和混合。然后加入1 ml 100％的乙醇，再次组合，在夜间沉淀于-20 ° C 10。反转录 20分钟转速15,000 RPM和4 ° C。去除上清液，并用0.5毫升80％乙醇沉淀。 7.25μLRNA /引物组合（6.25μl水0.5μLRclip底漆[0.5pmol/μl]; 0.5μLdNTP混合液[10毫米），重悬沉淀。对于每个实验或复制，使用不同Rclip的引物，包含个人的条码序列（见14）。 孵育5分钟，在70℃前冷却至25 ° C。 添加2.75μLRT组合（2μL的5倍RT缓冲; 0.5μL0.1M数码地面电视服务; 0.25μL标III逆转录Invitrogen公司]）。 孵育5分钟在25℃，20分钟，42℃，40分钟，在50 ° C和5分钟，在80℃前冷却至4 ° C。 加入90μLTE缓冲液，0.5μLglycoblue，10μL醋酸钠pH值5.5和混合。然后加入250μL100％的乙醇，混合和过夜沉淀于-20 ° C 11。凝胶纯化的cDNA 降速和洗的样本（见10.1），然后重新悬浮颗粒在水6μL。 加入6μL的2倍TBE -尿素样缓冲液（Invitrogen公司）。加热样品至80 ° C为直接装载前3分钟。 装入预制6％TBE -尿素凝胶（Invitrogen）的样品和制造商的180 V 40分钟运行。此外，负载低分子量标记，为后续的切削（见下文）。 削减120-200新台币（高），85-120 NT（中）和70-85 NT（低）三个波段。使用theupper染料，塑料凝胶支持的标志，引导切除术（见图3）。请注意，Rclip底漆和三层序列合计占52 NT的剪辑顺序。 加入400μLTE和粉碎成小块，用1毫升注射器的柱塞的凝胶片。孵育2小时在1100 RPM晃动在37 ° C。 将两个1厘米的玻璃预过滤器进入一个中光学SpinX列（康宁公司，8161）（滤纸，1823010）。液体样品的部分转移到列。自旋为1分钟到1.5 ml管13000 RPM。 添加0.5μLglycoblue和40μL醋酸钠的pH值5.5，然后混合样本。添加1毫升100％的乙醇，重新组合和过夜沉淀在-20 ° C。 12。 cDNA的5'端引物的结扎降速和洗的样本（见10.1），然后重新悬浮颗粒在8μL结扎组合（6.5μl水，0.8μL10倍CircLigase缓冲区第二; 0.4μL50毫米MnCl 2; 0.3μL; Circligase II [震中]），并培育在60 ° C 1小时加入30μl的寡核苷酸退火组合（26μl水; 3μLFastDigest缓冲[Fermentas公司; 1μLcut_oligo [10μM]）。孵育1分钟，在95 ° C。然后下降的温度每20秒1 ° C到25 ° C是达到了。 2μLBamHI位（快速Fermentas公司）在37和30分钟的孵化° C。 加入50μLTE和0.5μLglycoblue和混合。添加10μL醋酸钠pH值5.5和混合，再加入250μL100％的乙醇。再次在夜间混合和沉淀于-20 ° C 13。 PCR扩增降速和洗的样本（见10.1），然后在19μl水重悬沉淀。 准备PCR混合物（19μL的cDNA; 1μL引物组合P5/P3公司Solexa，每10μM; 20μLAccuprime Supermix 1酶[Invitrogen公司]）。 运行下面的PCR程序：94℃15秒，65℃30秒，30秒，68 ° C] 25-35个循环，68 ° C为3分，4个94 ° C，2分钟， ° C直到永远。 混合8μLPCR产物与2μL预制6％TBE凝胶上装载的5倍TBE缓冲和负载（Invitrogen）。 Sybrgreen我（Invitrogen）的凝胶染色，用凝胶成像仪分析。 在Rclip引物的条形码允许复用不同的样品的高通量测序之前提交。提交15μL测序库和存储休息。 14。链接程序和引物序列前adenylated 3'连接器的DNA： 我们为了从IDT的DNA适配器，然后分装的20μM。] 15。代表性的成果： 测序iCLIP库之前，实验的成功，可以监视两个步骤：膜内转印后的蛋白质- RNA复合物（步骤8.5）和PCR产物的凝胶图像（13.4步）放射自显影。在低核糖核酸样本的放射自显影，弥漫性放射性应被视为上述分子量的蛋白质（图2，样品4）。对于高核糖核酸样本，这种放射性是接近的蛋白质的分子量（图2，样品3）集中。如果没有抗体是免疫，应检测无信号（图2，样品1和2）。特异性免疫的进一步重要的控制，要么省略紫外线照射，或使用不表达的细胞蛋白质的利息14。 的PCR产物（13.4步）的凝胶图像显示大小的范围内，对应纯化步骤11.4（图4，泳道4-6）cDNA的部分（高，中，低）。请注意，PCR引物P3Solexa和P5Solexa，引入一个额外的76 NT的cDNA的大小。如果没有抗体的免疫过程中使用，没有相应的PCR产物（图4，泳道1-3）应检测。引物二聚体的产品可以出现在约140 NT。 对于代表的高通量的测序和随后生物信息学分析结果，看到14。 图1。iCLIP协议的示意图。蛋白质- RNA复合物共价交联用紫外线照射（步骤1）体内。感兴趣的蛋白质纯化与结合的RNA（步骤2-5）。为了让序列特异性逆转录吸，一种RNA适配器是RNA的3'端结扎，而放射性标记的5'端（步骤6和7）。交联蛋白- RNA复合物是免费的RNA纯化，用SDS – PAGE和膜内转印（步骤8）。 RNA是从膜回收，通过消化的蛋白质与蛋白酶K留在交叉链接核苷酸（步骤9）多肽其余。反转录（RT）在余下的多肽截断，并介绍了两种裂解适配器地区和条形码序列（10步）。大小选择删除前函证免费RT引物。下面的线性生成合适的模板进行PCR扩增（步骤11-15）。最后，高通量测序生成读取条形码序列会立即被最后的cDNA核苷酸（16步）。由于这核苷酸位于一个位置的交联核苷酸上游，结合部位，可以推导出高分辨率。 图2交联的核蛋白的C – RNA复合物的放射自显影使用变性凝胶电泳和膜转移。 （α核蛋白核蛋白的C – RNA复合物从细胞提取核蛋白彗星对使用一种抗体免疫纯化，样品3和4）。 RNA部分被消化，使用低（+）或高（+）浓度的RNase。可以观察到向上移位大小的蛋白质（40 kDa）的配合物（样品4）。这种转变是不太明显，当高浓度的RNase（样品3）。放射性信号消失时没有抗体用于免疫沉淀（样品1和2）。 图3。示意图6％TBE -尿素凝胶（Invitrogen公司），以指导切除iCLIP cDNA产物。凝胶是运行在180 V，导致重复的迁移模式的cDNA和染料在凝胶（光与暗蓝色）为40分钟。使用刀片切割（红线）高（H），中（M），低（L）cDNA的分数。开始在中间的淡蓝色染料，并立即上述商标切割塑料胶盒。划分中，低分数和修剪约1厘米以上的淡蓝色染料的高分数。使用的口袋和染料的指导下的垂直切割，分开不同的车道（在这个例子1-4）。标记巷（M）可以染色，成像控制后切割的尺寸。片段大小显示在右侧。 图4。iCLIP使用凝胶电泳PCR扩增cDNA文库的分析。 RNA收回膜（图1）反转录和大小纯化变性凝胶电泳（图2）。三个大小比例的cDNA（高[H +]：[M]：85-120 NT和低[左]：70-85 NT），中型120-200 NT被收回，发送，重新线性和PCR扩增。输入分数的大小不同的结果可以观察到不同的粒度分布的PCR产物。由于PCR引物的cDNA引入76 NT，尺寸范围应161-196新台币为高，中等和146-161粒级低的NT 196-276台币之间。 PCR产物均缺席时没有抗体是免疫（1-3车道）。