iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد
Summary
الترتيب المكاني للRNA البروتينات ملزم على نص هو أحد المحددات الرئيسية لمرحلة ما بعد النسخي التنظيم. ولذلك ، قمنا بتطوير الفرد والأشعة فوق البنفسجية النوكليوتيدات يشابك القرار ومناعي (iCLIP) الذي يسمح دقيقة الجينوم على نطاق ورسم خرائط للمواقع الملزم للبروتين النووي الريبي ملزمة.
Abstract
تركيبة فريدة والترتيب المكاني للRNA ملزم البروتينات (الممارسات التجارية التقييدية) على نسخة دليل الجوانب المتنوعة في مرحلة ما بعد النسخي البند 1. لذلك ، خطوة أساسية نحو تنظيم محضر التفاهم على المستوى الجزيئي هي لاكتساب المعلومات الموضعية على مواقع الربط من الممارسات التجارية التقييدية 2.
ويمكن دراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعلات الكيميائية الحيوية باستخدام الأساليب ، ولكن هذه الطرق لا تتناول الحمض النووي الريبي ملزمة في سياقها الأصلي الخلوية. المحاولات الأولية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي المجمعات في بيئتها الخلوية المستخدمة لتنقية تقارب أو مناعي جنبا إلى جنب مع الفرق عرض أو تحليل ميكروأري (RIP – CHIP) 3-5. وكانت هذه الأساليب عرضة لتحديد التفاعلات غير المباشرة أو غير الفسيولوجية – 6. يشار استراتيجية من أجل زيادة نوعية والقرار الموضعية ، على أنه قدم CLIP (الأشعة فوق البنفسجية عبر ربط ومناعي) 7،8. CLIP يجمع عبر ربط الأشعة فوق البنفسجية من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي مع مخططات تنقية صارمة بما في ذلك تغيير طبيعة بولي أكريلاميد هلام إستشراد. بالاشتراك مع تقنيات التسلسل عالية الإنتاجية ، وقد ثبت CLIP كأداة قوية لدراسة البروتينات والحمض النووي الريبي التفاعل على نطاق والجينوم واسعة (ويشار إلى CLIP – HITS CLIP أو بعدها) 9،10. مؤخرا ، تم إدخال PAR – CLIP يستخدم النظير لريبونوكليوزيد photoreactive عبر ربط 11،12.
على الرغم من نوعية عالية من البيانات التي تم الحصول عليها ، والتجارب CLIP كثيرا ما تولد من التعقيد مكتبات [كدنا] تسلسل محدودة. هذا يرجع جزئيا إلى كمية محدودة من شارك في المنقى واثنين من الحمض النووي الريبي RNA ربط الكفاءة ردود الفعل المطلوبة لإعداد المكتبة. بالإضافة إلى ذلك ، أشارت المقايسات تمديد التمهيدي cDNAs أن العديد من اقتطاع قبل الأوان بنسبة 13 في النوكليوتيدات crosslinked. يتم فقدان هذه cDNAs اقتطاع خلال بروتوكول CLIP معيار إعداد المكتبة. نحن وضعت مؤخرا iCLIP (فردية النوكليوتيدات CLIP القرار) ، والذي يجسد cDNAs اقتطاعها من خلال استبدال واحدة من الخطوات غير فعالة الربط بين الجزيئات RNA مع التعميم أكثر كفاءة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ [كدنا] (الشكل 1) 14. الأهم من ذلك ، تسلسل cDNAs اقتطاع يقدم أفكارا في موقف للموقع عبر وصلة في القرار النوكليوتيدات. طبقنا بنجاح iCLIP لدراسة الجسيمات C hnRNP منظمة على نطاق واسع الجينوم وتقييم دورها في تنظيم الربط 14.
Protocol
Discussion
منذ بروتوكول iCLIP يحتوي على مجموعة متنوعة من التفاعلات الإنزيمية والخطوات لتنقية ، فإنه ليس من السهل دائما تحديد المشكلة عند تجربة فشل. من أجل السيطرة على لخصوصية تحديد المواقع عبر الارتباط RNA ، ينبغي الحفاظ على واحد أو أكثر من عناصر التحكم في كافة مراحل التجربة السلبية الكاملة والتحليلات الحسابية لاحقا. يمكن أن تكون هذه الضوابط العينة عدم الأضداد ، والخلايا غير عبر ربط ، أو مناعي من الخلايا أو الأنسجة خروج المغلوب. من الناحية المثالية ، ينبغي أن تحكم هذه التجارب لا تنقي أي مجمعات البروتين RNA ، وبالتالي ينبغي أن تعطي أي إشارة على جل SDS – PAGE ، وليس بعد اكتشاف منتجات التضخيم PCR. ينبغي عالية الإنتاجية تسلسل هذه المكتبات التحكم عودة تسلسل فريد قليلة جدا. لا ينصح الخلايا ضربة قاضية كعنصر تحكم التسلسل ، لأن تسلسل الناتجة تقابل ما زال عبر ربط مواقع من البروتين نفسه الذي تتم تنقيته من الخلايا ضربة قاضية بكميات أصغر.
وينبغي أيضا الاحتياطات الواجب اتخاذها لتجنب تلوث المنتجات مع PCR من التجارب السابقة. أفضل وسيلة للحد من هذه المشكلة هو لفصل مكانيا الخطوات السابقة واللاحقة PCR. من الناحية المثالية ، ينبغي إجراء تحليل PCR المنتجات وجميع الخطوات اللاحقة في غرفة منفصلة. وعلاوة على ذلك ، يجب على كل عضو في المختبر استخدام الخاصة بها مجموعة من المخازن والكواشف الأخرى. في هذه الطريقة ، يمكن تحديد مصادر التلوث أسهل.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر جميع أعضاء المختبرات الندبة ، وLuscombe Zupan للمناقشة والمساعدة التجريبية. نشكر جيمس هادفيلد ونيك ماثيوز عن التسلسل الإنتاجية العالية. نود أن نشير إلى أن الأسلوب الموصوفة هنا iCLIP أسهم عدة خطوات مع بروتوكول CLIP الأصلي الذي وضعه جنسن كيرك وJU في مختبر روبرت دارنيل. وأيد هذا العمل عن طريق منح المجلس الأوروبي للبحوث 206726 – CLIP لJU والطويلة الأجل للعلوم الإنسان حدود الزمالة لبرنامج JK
Materials
For gel electrophoresis and membrane transfer we recommend t he use of XCell SureLock® Mini-Cell and XCell II™ Blot Module Kit CE Mark (Invitrogen, EI0002), which is compatible with the use of the different precast minigels that are specified throughout the protocol. The brand and order number of all materials used is mentioned during the protocol. The list of enzymes used in the protocol is shown in the table below.
| Name of reagent | Company | Catalogue # | Comments |
| Protein A Dynabeads | Invitrogen | 10001D | use protein G for mouse or goat antibody |
| RNase I | Ambion | AM2295 | activity can change from batch to batch |
| T4 RNA ligase I | NEB | M0204S | |
| PNK | NEB | M0201S | |
| proteinase K | Roche | 03115828001 | |
| Superscript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
| Circligase II | Epicentre | CL9021K | |
| FastDigest® BamHI | Fermentas | FD0054 | |
| AccuPrime™ SuperMix I | Invitrogen | 12342010 | this PCR mix gives the best results in our hands |
Referencias
- Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat Rev Genet. 8, 533-543 (2007).
- Wang, Z., Burge, C. B. Splicing regulation: from a parts list of regulatory elements to an integrated splicing code. RNA. 14, 802-813 (2008).
- Trifillis, P., Day, N., Kiledjian, M. Finding the right RNA: identification of cellular mRNA substrates for RNA-binding proteins. RNA. 5, 1071-1082 (1999).
- Brooks, S. A., Rigby, W. F. Characterization of the mRNA ligands bound by the RNA binding protein hnRNP A2 utilizing a novel in vivo technique. Nucleic Acids Res. 28, E49-E49 (2000).
- Tenenbaum, S. A., Carson, C. C., Lager, P. J., Keene, J. D. Identifying mRNA subsets in messenger ribonucleoprotein complexes by using cDNA arrays. Proc Natl Acad Sci. 97, 14085-14090 (2000).
- Mili, S., Steitz, J. A. Evidence for reassociation of RNA-binding proteins after cell lysis: implications for the interpretation of immunoprecipitation analyses. RNA. 10, 1692-1694 (2004).
- Ule, J. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302, 1212-1215 (2003).
- Ule, J., Jensen, K., Mele, A., Darnell, R. B. CLIP: A method for identifying protein-RNA interaction sites in living cells. Methods. 37, 376-386 (2005).
- Licatalosi, D. D. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456, 464-469 (2008).
- Yeo, G. W. An RNA code for the FOX2 splicing regulator revealed by mapping RNA-protein interactions in stem cells. Nat Struct Mol Biol. 16, 130-137 (2009).
- Urlaub, H., Hartmuth, K., Lührmann, R. A two-tracked approach to analyze RNA-protein crosslinking sites in native, nonlabeled small nuclear ribonucleoprotein particles. Methods. 26, 170-181 (2002).
- König, J. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nat Struct Mol Biol. 17, 909-915 (2010).
