单细胞的转录组学分析

1。细胞培养我们的实验室使用下面的实验的主要神经元大鼠海马文化。下面介绍如何创建和维护这些细胞培养的银行家协议 9，当然，这些细胞培养技术和任何既定的方法排列的详尽量身定做，它提供了一个特定的实验室的具体需求持续健康细胞的供应将是一个合适的替代。 五蒸压，圆形，12毫米盖玻片被放置在一个35毫米的菜，并涂以80μg/ mL的聚- D -赖氨酸在硼酸盐缓冲液O / N（兆瓦70-150,000），水（细胞培养级）冲洗，然后涂硼酸盐缓冲液O / N为1微克/毫升层粘连蛋白，然后再冲洗水。吴媒体（与Earle的盐和葡萄糖（0.6％W / V）为辅GlutaMAX，青霉素（100 ü /毫升），链霉素（100微克/毫升），马血清（10％V / V）的MEM）是补充和菜存储在一个孵化器（5％的CO 2，在37 ° C） 。 PDL150/laminin服务作为一个孤立的神经细胞成长为一个单层基板。可涂在盖玻片电镀前两个星期。 在电镀的日子，从胚胎第18天大鼠海马神经元的主要是镀吴媒体中加入1.5毫升100,000细胞/ mL悬液。电镀后的四到六小时，每35毫米的菜是用0.75μL5毫米胞嘧啶β- D – arabinofuranoside（ARA – C），以防止任何污染的神经胶质细胞的生长。二十四小时后，电镀媒体更改为纪念厄尔的盐和L -谷氨酰胺，0.6％W / V葡萄糖，丙酮酸钠1毫米，和B27的补充。细胞被允许使用任何实验前增长至少两个星期，让完整的开发过程。 2。准备移液器注：对核糖核酸酶的皮肤，唾液，甚至呼吸酶降解RNA的RNase的主要来源。当务之急是从这个角度观察，无RNase的技术，使样品不会成为与RNase的污染，并随后降解的协议。这包括处理的样品和试剂时，总是戴着手套，从来没有超过样本或试剂，并使用新箱消毒枪头和管子。通常情况下，不专门指定用于RNA工作的移液器净化抹下来核糖核酸酶处理解决方案，如核糖核酸酶距离（分子生物制品）。然而，这些解决方案将抑制任何下游的酶反应，所以它也是重要的，以防止这些治疗你的样品污染。 高压灭菌1.5毫米外径（OD值）玻璃吸液管。 使用微量拉马，拉移液管直径适当的电生理记录，这可能会有所不同根据你的车夫，长丝， 移液器 10孔尺寸是不是太重要，因为尖端细胞采集前将被打破。 小心地保存在一个无尘的环境中的提示将保持不变（最好使用微量存储罐）移液器。 要在受控制的方式打破的提示，一方面举行绷紧你的手指之间和一个kimwipe非常吸管尖轻轻刷整个文件的1至2次。开放应靶细胞的大小约为75-100％。调整此步骤，直到达到预期的效果。 3。准备文化，管，显微镜准备所需数量的1.7 mL的Eppendorf管。如果是单细胞扩增，或任何其他的收获材料的存储解决方案中使用的材料，加入2μL的PBS，第一链缓冲。 收获，您将需要与光镜装有一个显微一个40x的目标。软管领先远离持有人使用吸管持有人。油管贴上一个稳定的表面，以防止不必要的运动期间收集的吸管。在管端插入针与鲁尔锁连接，使一个1 mL注射器可以在用户之间的连接和改变。 如果使用盖玻片，工作一次盖玻片。如果有必要，转让一个新的35毫米盘*含有PBS或媒体选择单一盖玻片。时间越长，细胞的孵化器，更不健康，他们将成为和mRNA的配置更会偏离一个健康细胞。它是保存在孵化，在不与他们合作的其他盖玻片上的细胞的健康至关重要。尽快与孵化器以外的细胞。 *随着我们的设置是必要的，实际菜的墙壁是用35毫米盘的盖子，因为太高，允许对coversli适当的微进步第 4。收获细胞安全的微量微量持有。贴上微量持有人的micromanipulators插入。设置的40倍，目标。 将菜在显微镜舞台上找到一个适合收获的细胞区域。在初级神经元文化的情况下，细胞从它的邻国应相对隔离，以防止周围的细胞和/或进程的收获。 SOMA和流程之间的mRNA转录的人口变化，如果在体mRNA的感兴趣只，护理应采取措施防止污染与流程SOMA。将你想收获的细胞在视野的中心。 使用显微走向菜光路的解决方案的微量。降低到解决方案的枪头。应用正压从这个角度上，轻轻吹通过注射器。看看通过目镜。移液器应该出现在视野的阴影。远高于飞机的细胞，调整枪头的位置，直到它吸管尖粗的聚焦旋钮上的观点和重点领域内的。在这一点上，它应分摊的吸管孔的大小，如果过大或过小。实践收获会提供的能力，以确定正确的孔径大小，如果在这一点上已经取得。 现在，提前向细胞的平面吸管。它是非常重要的提示是没有先进的太匆忙，造成它打破你想收集该地区从。为了防止这种情况，使用粗的重点，以推进推进对使用micromanipulators细胞枪头前焦平面。当你接近的细胞，用优良的焦点，直到细胞和枪头重点。停止应用正压之前到达飞机的细胞，以防止吹盖玻片。 使用micromanipulators位置枪头，因此，它是触摸你想收获的细胞SOMA。 使用注射器，适用于经口轻轻吸气​​，待细胞进入枪头。如果细胞是不能进入的吸管，轻轻地尖接近细胞和向下移动，直到它从盖玻片升降机。 5。保存细胞使用显微操作，立即采取行动解决方案的吸管和。 删除从持有人的吸管。 一方面保持1.7 mL Eppendorf管中，并轻轻地打破移液器管的底部侧面提示。 （0.1毫升大关的目标。） 断尖为中心的管内，插入到顶端开口的吸管连接1-3毫升注射器针头。迅速压低柱塞迫使移液器的解决方案，喷入管。细胞应该留在最顶端的吸管和正确驱逐细胞，这应该是足够的。要小心不要接触任何液体管双方的提示毛细作用把吸管的液体倒回。 快速降速使用的是台式离心管的内容，并立即冻结（储存于-80 ° C），或作进一步处理（最好）的冰地。 6。 ARNA扩增第1轮第一链cDNA合成： 创建的mRNA / cDNA的杂交。 对于每一个单细胞采集量的5μL，添加下列1X收集管（冰）。反应可缩放收集量较大（2X 10μL收集卷等）。收集管加10-20％乘以下列试剂移液错误的帐户创建一个主结构。 ARNA ampification过程中的每一个后续反应。 在ICE 1.2μL，dNTP的（2.5毫米） 2.4μL，5倍的第一链缓冲 0.3μLT7 -寡核苷酸（dT）引物（100纳克/μL） 1.2μL的数码地面电视（100毫米） 把音量高达10.25μL与核酸自由水。移液器组合和旋转简要使用离心。 孵育5分钟，在70 ° C变性任何的mRNA的二级结构。立即置于冰上至少5分钟。 添加（再次使用预混）： 0.3μL，RNasin（40 U /μL） 0.45μL标三（200 U /μL） 1μL的核酸游离水移液器组合和旋转简要。孵育1小时42 ° C。 在70 ° C下孵育15分钟灭活上标。继续进行下一步。 第1轮第二链cDNA合成创建从mRNA部分的mRNA / DNA杂交的RNA引物，以帮助合成Øf双双链cDNA。 在ICE 12μL第一链反应，地址： 8μL的核酸游离水 7.5μL，5倍的第二链缓冲 0.75μLdNTP混合液（2.5毫米） 0.25μL，DNA连接酶（10 U /μL） 1μL，DNA聚合酶I（10 U /μL） 0.25μL，核糖核酸酶H（2 U /μL） 吹打调匀，和旋转简要。孵育2小时，在16 ° C。 地址：1μLT4 DNA聚合酶（5 U /μL）。混合吹打和自旋简要。在16 ° C孵育10多分钟清理反应使用的Qiagen公司MinElute试剂盒，为制造商的指示稍作修改 ：11与500μL洗涤缓冲液750μL1次洗2次。洗脱核酸自由水。 集中到2-4微升使用Speed​​vac或乙醇沉淀。乙醇沉淀，糖原作为一种核酸的载体和沉淀少量的DNA或RNA时使用。钠醋酸钠有助于中和负电荷的DNA骨干，帮助降水。这是没有必要让一个常规降水的主组合。 加入29μLDEPC水 2μL，糖原（5mg/mL） 1 / 10的体积（3μL）3M醋酸钠 2.5卷（〜250μL）的100％冷乙醇拌匀。沉淀于-80℃（30分钟O / N）。 离心20分钟，在4 ° C。 去除上清，用800μL70％乙醇洗涤沉淀。请务必完全逐出吹打或振荡，以帮助清除多余的盐分沉淀。 离心20分钟，在4 ° C。取出上清，空气干燥15-20分钟。 悬浮在4μL核酸自由水。贮存于-20℃或-80 ° C或继续下一步。 回合在体外转录（IVT），1： 综合纳入到双链cDNA T7启动子的反义RNA。 这种反应是执行每除一个，而不是一个20μL的反应10μL，规模的制造商的说明使用的Ambion公司MEGAscript T7套件。12因此，以装配在室温下这种反应和以保持室温在组装过程中的缓冲区。提供的缓冲区，将沉淀的DNA，如果它是冰冷的。冰在不使用时保持NTPS和酶混合。 AT室温双链的悬浮基因转移到薄壁PCR管。 4μL的NTP混合（18.75毫米） 1μL10X反应缓冲液 1μL，10倍的酶混合物 14个小时在37 ° C的一个热循环仪（最好）或孵化器。 这种反应可以使用两种不同的方法使用Speed​​vac或乙醇沉淀的样品浓度清理。对于使用一个工具包清理，进行A.清洁与一个标准的酚/氯仿抽提方法，进行方法B 方法A： 清理反应使用Ambion公司Megaclear套件，为制造商的说明了一些修改 13：洗2次，与500μL洗涤缓冲液750μL1次。洗脱步骤，添加50μL的核酸自由水中心之列，在70 ° C孵育10分钟。 10,000克为1分钟旋转。在一个新的管重复。合并洗脱液。 2-4μL使用Speed​​vac或乙醇沉淀浓缩样品。 乙醇沉淀：醋酸铵在这种情况下，醋酸钠的地方使用，因为它是有效地防止游离核苷酸与核酸共同沉淀。这是很重要的，因为高浓度的NTP公司在IVT中的反应，它可以抑制下游反应使用。 加入50μLDEPC水 2μL，糖原（20毫克/毫升） 0.6卷（37.2μL），5M醋酸铵 2.5卷（〜180μL），冷乙醇沉淀于-80℃（30分钟O / N）* 离心20分钟，在4 ° C。 取出上清液，沉淀用800μL70％乙醇（核酸免费水）。一定要充分打跑的沉淀，去除所有多余的盐分。 离心20分钟，在4 ° C。 除去上清，空气干燥15-20分钟。 4μL的核酸自由水的悬浮颗粒。 方法B： 另外，ARNA可以清理一个标准的酚/氯仿抽提。 加入50μLDEPC水 2μL，糖原（20毫克/毫升） 0.6卷（37.2微升）5M醋酸铵 1卷（98μL），酚：氯仿：异戊醇25:24:1（平衡pH值7.8-8.0） 涡为15秒。一半在表顶部的离心的最大速度为1.5分钟，离心。顶部的水层转移到一个新的试管中，2.5倍体积的冷乙醇（245μL）。 沉淀于-80℃（30分钟O / N）。 离心20分钟，在4 ° C。 800μL70％乙醇（核酸游离水），取出上清液和洗涤沉淀。一定要充分打跑的沉淀，去除所有多余的盐分。 离心20分钟，在4 ° C。 除去上清，空气干燥15-20分钟。 4μL的核酸自由水的悬浮颗粒。 *样品，可能会冻结在此温度下在一夜之间孵化。它已被证明，这实际上可以增加产量核酸。 第2轮第一链cDNA合成在ICE 添加1μL，随机引物（0.05毫克/毫升）* 热火在70 ° C 10分钟。立即置于冰上至少5分钟。 添加2μL，5倍的第一链缓冲 1μL的数码地面电视（100毫米） 0.5μL，dNTP的（2.5毫米） 0.5μL，RNasin（40 U /μL） 1μL标三（200 U /μL） 吹打调匀，和旋转简要。允许在室温下坐了10分钟。这一步是必需的，允许延长短的随机引物，逆转录反应之前进行。 孵育30分钟，在42 ° C。 加热5分钟在95 ° C至变性DNA / RNA杂交的RNA。置于冰上至少5分钟。储存在-20 ° C或-80 ° C或立即继续下一步。 *随机引物的浓度是重要的。如果浓度过高，该产品将每一轮的放大截断。 第2轮第二链cDNA合成在ICE 添加2μL，T7，以oligo（dT）引物（10毫微克/μL）* 在70 ° C 5分钟热立即置于冰上至少5分钟。自旋简要。 新增43.5μL的核酸自由水 15μL的5倍第二链缓冲 1.5μLdNTP混合液（2.5毫米） 2μL，DNA聚合酶I（10 U /μL） 吹打调匀，和旋转简要。孵育2小时，在16 ° C。 加入2μLT4 DNA聚合酶（5 U /μL） 吹打调匀，和旋转简要。在16 ° C孵育10多分钟清理在6.2.3节中使用的Qiagen公司Minelute试剂盒的反应。 在第6.2.4至6.2.8与Speed​​vac或乙醇沉淀，浓缩到2-4μL。 *注引物T7寡糖不同的股权集中度（DT）相比，第一轮第二链cDNA合成。 第2轮在体外转录 6.3节中演出。 重复第6.4至6.6倍所需的数字。注意，每一轮ARNA产品在较短的扩增结果的后续。轮扩增的数量应限于这个原因。通常情况下，放大两到三个回合足够的放大，从一个单一的细胞进行基因芯片分析收获的材料。在微阵列分析的情况下，第三轮IVT反应是为制造商的指示使用Illumina公司TotalPrep RNA扩增试剂盒。此过程纳入ARNA检测微阵列芯片上，然后将其使用的生物素标记的UTP。 第三轮ARNA纳米RNA试剂盒使用一个Nanodrop或安捷伦生物分析仪测量的浓度。 7。代表性的成果在不到2分钟就可以完成从初级神经元文化的一个单细胞收获成功，取决于性向（见图1）。然而，收获的时间会有所不同系统之间和干预实验操作。单细胞受到ARNA程序（见图4A及4B）在总放大ARNA微克金额的结果，并产生特有的宽峰分析与生物分析仪（见图3）。三个回合就可以完成了至少3天，允许单细胞基因表达的快速分析。 图1所示是一个一个孤立的神经元的收获成功的一个例子。我们塞莱反恐执行局的一个相对较低的密度区域（一）向所需的细胞（B）和先进的枪头。第三个图像（c）显示，已经收获后的细胞领域。需要注意的是周围的进程保持盖玻片。 图2所示的两幅图像枪头，这是一个有效的收获不恰当的大小。这些技巧会导致不完整的收获（A）和周围环境（b）分别收获。 图3。以下收获和使用一个生物分析仪的放大，分析，建议检查扩增RNA的分布和数量。一个从单细胞的物质成功扩增产量低微克的总金额，将有一个平稳和广泛的分布。 第一轮（A）和（二）ARNA程序的第二轮的原理图图4所示。