의 복합 식물의 생성 Medicago truncatula 유괴의 Assays 사용

다음 프로토콜은 모델 콩과의 식물 종 M.에 털이 루트 복합 발전소를 생성하는 데 사용되었습니다 truncatula. 비슷한 프로토콜은 적어도 8 식물 종의 1-4에 맞게 조정되었습니다. 우리는 M. 사용 truncatula 털이 루트 복합 식물 뿌리와 결절 개발에 유전자 기능을 연구하기 위해 서요. 털이 루트 복합 발전소를 생성 2),, 3) 공생 Rhizobia 감염, 그리고 4) 유전자 변형 루트 식별을 준비하는 식물 재료에게) 1 : 프로토콜은 4 개의 섹션으로 분리되었습니다. 우리는 합성 유전자 변형 식물의 뿌리 3 검사의 기자로 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자를 포함하는 바이너리 벡터를 사용합니다. 항생제 기반의 선택에 비해 GFP 기반의 심사는 빠르고 쉽게, 그리고 저렴합니다. 우리 구조에서 ER 표현 최적화된 GFP 유전자는 유전자 변형이 아닌 유전자 변형 뿌리 사이에 쉽게 구별 수 있도록 유전자 변형 뿌리에 강한 제정 GFP 신호를 가지고있는 슈퍼 ubiquitin 발기인에 의해 구동됩니다. 1. 식물 재료 준비 M. truncautla의 씨앗은 온실 재배 식물 (50 % 상대 습도, ​​8분의 16 H 조명 / 어두운, 18분의 22 ° C 주 / 야 온도)에서 수확하고 있습니다. 성숙한 종자는 4 ° C.에 저장할 수 있습니다 약 100 씨앗은 정기 잡고 10 분 10 ML 집중 황산 (95-98%, 시그마 – 알드리치, MO)에 scarified 있습니다. 씨앗은 부드러운 교반과 멸균 물을 5-7 번 씻어서 있습니다. 씨앗은 다음 6 시간 동안 실온에서 물에 흠뻑 젖고 ° C가 36-48시간에 대한 발아를 동기화 4 보관됩니다. 약 20-30 종자는 페트리 접시에 배치 젖은 여과지에 보급하고 있습니다. 그들은 22 ° C 유지를 μmol.m -2 8분의 16 H 조명 / 어두운주기, 그리고 40. S -1 빛의 강도는, 5-6 일간. Germinated 모종은 흙으로 전송하고 한 달 동안 온실에 배치됩니다. 2. 헤어 루트 복합 식물을 생성 관심 유전자를 갖고 이진 구성 요소 A.으로 변형되었다 표준 프로토콜을 사용 rhizogenes. 우리는 유전자 변형 조직 검사를 용이하게 마커로서 GFP 유전자를 포함하는 바이너리 벡터의 집합을 꾀하고있다. 이 벡터는 다양한 발기인을 포함하고 모두 이상 표현이나 타겟 유전자 3,5의 입을위한 게이트웨이 복제 사이트 (Invitrogen, 칼스 배드, CA) 있습니다. A. rhizogenes의는 28에서 적절한 항생제 선택과 50ml LB 배지 ° 16~24시간 들면 C에서 양식입니다. 박테리아는 질소없는 식물 영양소 솔루션 (표 1, 6) = 0.3를 수집하여 OD 600의 최종 농도에 다시 중지합니다. 털이 루트 재생, 소독 지원 매트릭스 (이하 "록 양모"Hummert 국제, 지구시, MO)을 지원하기 위해하는 것은 약 3cm 3 플러그로 절단됩니다. 하나는 페트리 접시에 4 플러그를 놓으십시오. 구멍 explants의 삽입을 용이하게하기 위해 피펫 팁을 사용하여 각 플러그 위에 찌르고있다. A. rhizogenes (5 ML)은 각 플러그인에 추가됩니다. 2-3 겨드랑 꽃봉오리와 촬영 섹션 슬랜팅 절단에 의해 excised 수 있습니다. explant은 다음 플러그에 삽입하고, 22 ° C 3 주에 대한 성장이다. 우리는 물이 그들을 5 ML 질소 무료 솔루션을 필요한 경우와 다음, 처음 10 일 동안 물을없이 Medicago의 explants을 유지. 우리는 혀끝의 분열 조직을 제거하는 것은 우발적인 뿌리의 형성을 낮출 수있는 것으로 나타났습니다. 3. 공생 Rhizobia (Sinorhizobium Meliloti) 감염증 3 주 후에 어떤 우발적인 뿌리가 록 양모에서 나타날 것입니다. 털이 루트 복합 식물은 록 양모에 관계없이, 모래 또는 vermiculite (소독)으로 전송됩니다. 그들은 22 온실에서 재배 ° C, 8분의 16 H 조명 / 어두운 사이클, 300 μmol.m -2. S는 1 주일 -1 빛의 강도. rhizobia 감염, S. 이전에 meliloti 1201 50 ML 효모 추출물 – mannitol 30 ° C (표 2, 6,7)에서 7 일 동안 매체 양식입니다. 다시 정지 rhizobia 세포는 OD 600의 최종 농도 = 0.08 사용하여 질소 무료로 영양 솔루션으로 희석하고 있습니다. S.의 10 ML 신선한 서스펜션 meliloti는 결절 형성을 유도하기 위해 각각의 합성 공장에 적용했다. 4. 유전자 변형 루트 식별 두 주 rhizobi​​a 접종 후, 합성 식물은 물에 세척에 의해 뿌리입니다. 뿌리는 쉽게 물에 모래 또는 펄라이트 분리 수 있습니다. 우리는 UV – 현미경 (니콘 SMZ1500, 여기 460 – 500nm, 505nm 이색성, 510nm 이상의 배리어)에서 털이 뿌리를 놓으십시오. 형질 뿌리는 GFP 양성하고 우발적인 뿌리는 GFP 아무것도 없습니다. 우리는 다음 뿌리 accordin를 수집g GFP 신호, 그리고 결절 번호를 카운트 루트 길이를 측정하고, 측면 루트 밀도를 계산합니다. GFP 부정적인 뿌리는 컨트롤로 사용됩니다. 5. 대표 결과 우리의 실험에서 새 머리카락 뿌리는 A. 후 2-3주에 explants에서 재생 rhizogenes innoculation. UV – 현미경, GFP 유전자를 가지고 유전자 변형 뿌리는 강한 녹색 형광 (그림 1)를 보여줍니다. 재생 뿌리와 GFP 긍정적인 뿌리 부분의 금액은 explants 및 복합 plants.On 평균의 성장 환경의 조건에 따라, 생산 뿌리의 25 %가 유전자 변형 털이 뿌리 셋 있었다. 변환 효율, 1)를 향상시키기 위해 로 비디오에 표시된 플라스틱 커버 운명은, 처음 몇 일 동안 성장 트레이에서 습도를 유지하기 위해 충분하고, 식물은 처음 며칠 동안 약간의 물을 필요로합니다. 과도한 관수는 털이 루트 형성에 해로운이며 2) Agrobacterium innoculant의 농도가 변화하는 것이 중요합니다. 세포의 과도한 금액은 털이 루트 형성 또는 결절 형성에 도움이되지 않습니다. 결절 형성은 물을 솔루션은 질소 무료 있어야합니다, 그렇지 않으면 몇 nodules가 형성됩니다. 털이 루트 복합 식물은 시작 물질로 cotyledons 또는 entact의 모종을 사용하여 생성할 수 있습니다. 위의 프로토콜만이 사소한 변경은 다른 조직 8 털이 뿌리를 생성할 수 ncessary 있습니다. 중요한 것은 각각의 털이 루트는 독립적인 변환 이벤트입니다. 따라서 하나의 합성 공장에서 관찰 phenotypes 여러 복합 식물의 반복에 의해 확인하는 데 필요한 몇 가지 transforamtion 이벤트의 총합으로 이루어진 그림 1. A. 형질 전환 뿌리는 털이 뿌리에서 밖으로 정렬할 수 있습니다. B.의 Nodules는 털이 루트 합성 공장에서 형성되었다. 우리는 4 주 된 M. 배치 UV – 현미경과 GFP 긍정적인 뿌리 아래에 truncatula 털이 뿌리 식물을 쉽게 확인할 수 있습니다. (레드 애로우 : GFP 루트, 노란색 화살표 : 비 – GFP 루트) 재고 g/200ml ML 재고 / 리터 MgSO 4 0.7 H 2 O 12.3 2 CaCl 2 0.2 H 2 O 14.7 4 K 2 HPO 4 0.3 H 2 O 6.8 1 K 2 SO 4 11 4 철 Club 호텔 3 0.6 H 2 O 0.49 2.5 Micronutrients 아래 참조 1 Micronutrients 리터 당 g H 3 BO 3 0.142 MnSO 4. H 2 O 0.077 ZnSO 4 0.7 H 2 O 0.1725 CuSO 4 0.5 H 2 O 0.037 NaMoO 4. H 2 O 0.024 CoCl 2. H 2 O 0.0025 NiSO 4 0.001 표 1. Nitogen없는 영양 솔루션 K 2 HPO4 0.5g NaCl 0.1g MgSO 4 명이 7H 2 O 0.2g 효모 추출 0.4g Mannitol 10g 산도 = 6.8 표 2. 효모는 (리터 당) mannitol 미디어를 추출