Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

1. Protein Ekspresyonu PTLN 11 veya pSG01MX 12 gibi Xenopus laevis oosit ifade için uygun bir vektör içine ilgi membran proteini klonlama. Optimize edilmiş vektörler hem 5 've 3' Xenopus laevis β-globin çevrilmemiş bölgelerde 11,12, benzersiz bir kısıtlama sitesi ve 5 'UTR 11 önce bulunan bir RNA promoter içerir. Bu bileşenler, sırasıyla en iyi oosit ifade, mRNA sentezi ve mRNA sentezini önce plazmid doğrusallaştırma, için gereklidir. 2. Sistein Mutasyon Kyte Doolittle arsa (ProtScale, EXPASY) 13 protein, amino asit dizilimini kullanarak, hedeflenen protein transmembran etki alanı tanımlamak için kullanılır. Veri hidrofobik vs sıra numarası olarak görüntülenir. Pozitif değerler görüntüleyen Kalıntılarının büyük olasılıkla transmembran etki alanı bulunmaktadır. Bu komplo, sistein için mutasyona uğramış olacaktır transmembran ve ekstrasellüler etki alanları arasındaki arayüzü bulunan en olası artıkları belirlemek için kullanın. Transmembran etki alanı ve ekstraselüler bölge arayüz Kyte Doolittle arsa kullanarak tam kesin olarak tahmin edilemez belirlenmesinde olduğu gibi, bir dizi arayüzü tahmin kalıntıları incelemek için önemlidir. Fluorophore.During konformasyonel bir değişim hareketi tahmin edilen protein Bu bölge için seçilen fluorofor Hidrofilik ve hidrofobik bir ortamda arasında ya da daha fazla su verme ve daha az su verme ortamı arasında hareket edecektir. Her ortamda bu öngörülen değişiklikler floresan yoğunluğunda bir değişikliğe yol açacaktır. QuickChange Site Yönetmen Mutagenez Kiti (Stratagene) ekstraselüler erişilebilir tek sistein yapıları oluşturmak için kullanılır. Kısaca, 10X reaksiyon tamponu 2, 5 ng / mcL plazmid DNA mcL, 1,25 mcL her 100 ng / mcL ileri ve geri astar, 1 mcL dNTP (100 mM) ve çift distile 39,5 mcL 5 mcL karışımı su. Son olarak, 1 PfuTurbo DNA polimeraz (Stratagene) mcL ekleyin. Bu adım için kullanılan primerler bir ilgi ekstrasellüler kalıntı sistein mutasyonu ile tasarlanmış olmalıdır. Program aşağıdaki özelliklere termal cycler: 1 döngü 95 ° C, 30 saniye 30 saniye 95 ° C'de 12-18 döngüleri, 55 ° C'de 1 dakika ve 68 ° C kb plazmid süresini 1 dakika. Tavlama sıcaklığı (55 ° C) Her bir astar erime sıcaklığı doğrudan hesaplanır. Reaksiyon gecede yapılır ° C eğer son bir adım 4 sıcaklığı tutmak için programlanmış olabilir. Döngü sayısı mutasyon bağlıdır. Birden fazla amino asit eklemeler için nokta mutasyonları, tek bir amino asit değişimi için 16 kür, veya 18 döngü için 12 döngüleri kullanın. Reaksiyon karışımı, pipetleme karışım ve 1 dakika boyunca santrifüj (6000 rpm) DpnI (New England Biolabs) 1 mcL ekleyin. 1 saat 37 ° ° C'de su banyosunda. Buz ve inkübe steril SOC medya (20 mg / ml Tripton, 5 mg / ml maya özü, 1 mg / ml NaCl, 0.4 mg / ml KCl, 0.02 M Mg 2 +, 0,02 çözülme ilk 10 elektro-yetkili hücreleri (Invitrogen) gerekli ° C kadar 37 M glukoz, ddH2O). 20 kısım 1.5 ml santrifüj tüpleri içine hücreleri mcL ve hücreleri sindirilir DNA 1 mcL ekleyin. Hücre Porator (Life Technologies) buzlu su ile doldurun μF, 4 kÊ Gerilim-Booster ücretsiz hızlı hızı ve direnci 330 kapasitans ayarlayabilirsiniz. Pipet 20 hücre / hücre porator küvetler içine DNA çözüm mcL. Hücre-Porator küvetler yerleştirin, kapağını kapatın, güç kablosunu bağlayın ve doğru küvet çevirin. Voltaj 430 okur kadar şarj edin ve 'up' tutmak için güç kaynağı ayarlayın. Kol ve tetik tuşuna basın kadranını. Bir patlama sesi varsa, elektroporasyon yeniden deneyin. Küvet hücreleri pipet ve 1.5 mL SOC medya aktarabilirsiniz. 1.5 saat 37 ° ° C'de sallayarak ile. 30 LB / ampisilin agar plakları (10 mg / ml Tripton, 5 mg / ml maya özü, 10 mg / ml NaCl, 15 mg / ml agar, GKD 2 O ve 100 ng / mcL ampisilin SOC / hücre çözümü mcL Transfer .) Plaka üzerinde hücrelerinin yayılmasını ve ° C gecede 37 plaka kuluçkaya yatmaktadır. Hasat tek plakaları koloniler ve LB / ampisilin (10 mg / ml Tripton, 5 mg / ml maya özü, 10 mg / ml NaCl, 100 ng / mcL ampisilin GKD 2 O) ortam içeren 5 ml kültürü aşılamak. 37 çalkalayınız ° C 16-20 saat. Nucleospin Plazmid kiti (Macherey-Nagel) kullanarak bir DNA miniprep gerçekleştirin. Niteliksel agaroz jel elektroforezi ile ürün inceleyin. Nanodrop 2000c Spektrofotometre (Thermo Scientific) kullanarak DNA verim Quantitiate. DNA dizi mutasyon ekleme olun. <p class="Jove_title"> 3. mRNA sentezi 37,0 az 1 saat 5 mcL uygun tampon ve restriksiyon enzimi 1 mcL ° C ile 50 L reaksiyon hacmi DNA plazmid DNA sindirimi 3 mikrogram linearize Yüksek Saf-PCR Ürün Arıtma Kiti (Roche Uygulamalı Bilimler) kullanarak, sindirimi şişe ve vorteks kısaca 350 mcL bağlayıcı tampon ekleyin. Bu kit, ürün RNA notu yapar guanidiniumisothiocyanate içerir olarak kullanılmaktadır. Toplama tüpleri spin sütunları ve sindirimi DNA çözümü ile sütun yük. 20 saniye boyunca 18.000 g de santrifüj ve flow-through atın. Sütun yıkama tamponu 500 mcL ekleyin. 18.000 g de 20 saniye santrifüj ve akış atın. Sütun yıkama tamponu 200 mcL ekleyin. 30 saniye Santrifüj veya sütun 18.000 gr kuru kadar Otoklavlanmış 1.5 ml santrifüj tüpüne spin sütun ve sütun 50 mcL DEPC arıtılmış su ekleyin. G. 18.000 az 30 saniye süreyle santrifüj tarafından Zehir Çözüm 3 mcL 0.5 mikrogram sonuçları yaklaşık 15 mcL yıkandı, DNA konsantre ol. Plazmid DNA (SP6, T7) organizatörü site sırasına göre doğru mMessage mMachine Kiti (Ambion) seçin. 5 mcL 1 NTP-cap karışımı, önceki adımda 3 mcL Lineerleştirilmiş DNA, 1 mcL transkripsiyon tampon ve uygun RNA polimeraz 1 mcL ekleyin. 37 1.5-2 saat inkübe ° C. Için en az 30 dakika boyunca yağış kiti LiCl 12.5 mcL, 15 mcL DEPC su karışımı kısaca (vorteks), 10 saniye boyunca 11.000 g de santrifüj ve -20 ° C'de saklayın ekleyin. Pre-soğuk santrifüj 4 ° C ve yağış sonra tam hızda en az 15 dakika santrifüj. Santrifüj sonra kahverengi bir pelet tüpün alt kısmında görünür olmalıdır. Dikkatle ve tamamen süpernatant kaldırmak ve -20 ° C'ye kadar soğutulur% 70 RNA dereceli etanol 150 mcL ekleyin Tam hızda 5 dakika süreyle 4 ° C'de santrifüjleyin. Bir Eppendorf Vacufuge Plus tamamen kısaca kuru süpernatant (1-2 dk) çıkarın ve DEPC su 12 mcL artık beyaz pelet çözülür. MRNA Nanodrop 2000c Spektrofotometre (Thermo Scientific) kullanarak verim Quantitiate. 4. Oosit Kaldırma Bu protokol, TEFE Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır. Operasyon öncesinde, ameliyat sırasında kurbağa kusmayı önlemek için 12 saat aç olmalıdır. Suda çözünmüş 0,5-3,0 g MS-222 bir çözüm olun. Çözüm pH 7,0-8,0 kadar sodyum bikarbonat ekleyin. MS-222 ameliyat sırasında kurbağa için bir anestezik olarak kullanılır. MS-222 taşıma sırasında her zaman nitril eldiven giyin ve bir kimyasal kaputun altında çözüm hazırlamak için önemlidir. MS-222 çözümü kurbağa kurbağa düzeltilmesi ve ayak tutam refleksleri kaybolmuş kadar bırakın. Yanıtsızlık kontrol etmek için, kurbağanın parmak çimdik. Islak bir bezi ped emici yan sırt tarafında kurbağa yerleştirin. Bu kurbağa cilde zarar görmesini engeller. Kurbağa ameliyat boyunca nemli tutulmalıdır olarak, ıslak bir kağıt havlu her zaman kurbağa yakın tutun. Kurbağa gözleri açıksa, onları tuzlu su solüsyonu ile nemlendirin önemlidir. Kurbağa uyanış belirtileri gösteriyorsa, anestezik solüsyonun kurbağa üzerine dökün ve kurbağa tepkisiz hale gelinceye kadar bekleyin. Ikinci ayak parmağı prosedür devam etmeden önce bir tutam gerçekleştirin. Coelomic kurbağanın orta hatta sol veya sağ ya da küçük bir kesi olun. Kesikler sonraki ameliyatları yanında alternatif yapılmalıdır. Kurbağa dış yumurtalık getirin ve yumurtalık kaldırmak. Kurbağa cilt yumurtalıklar dokunmaktan kaçının. Kanama olursa, kanama durana kadar, steril bir Q-tip ile basınç uygulayın. 3,0-4,0 Ethicon Vicryl dikiş materyali (Johnson & Johnson) ile bir dikişler ile kesi dikin. Dikilmesi zaman, bir defada bir düğüm ve kurbağa cilt dokunmamak için cerrahi aletler kullanın. Coelomic ve deri katmanları ayrı ayrı sütür için de önemlidir. Bu Xenopus laevis oosit yumurta ve hasat için NIH Kuralları (bakınız ile tutarlı http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). Ameliyattan sonra, kurbağa, en az 2 ay boyunca operasyon geçirmesi olmamalıdır. Kurbağa sonraki ameliyatları geçmesi kadar sağlıklı olup olmadığı da tespit edilmelidir. 6. cerrahi terminali ile her kurbağa maksimum 6 ameliyatları yapılabilir. 5. Oosit Defoculation ve mRNA Enjeksiyon Izole over lob makas ile küçük parçalara ayrılır. Kümeleri Ringer Solüsyonu kollajenaz + Ca 2 + (8.6 aktarılırg / L NaCl, 0,3 g / L KCl ve 0.33 g / L CaCl 2). 2 saat için 18 ° C'de yavaşça sindirmek çözümü sallamak Ca 2 + (8.6 g / L NaCl ve 0,3 g / L KCl) – en oosit ayrılır, Ringer Solüsyonu ile oosit yıkayın. Ringer Çözüm on dakika oosit inkübe – Ca 2 +. Ringer Solüsyonu + Ca 2 + oosit aktarın. 3.5 "Drummond kılcal tüpler Not Nanoject II Auto-Nanoliter Enjektör (Drummond) ile 50 nL son bir hacmi, 25 ng mRNA ile oosit enjekte: mRNA miktarı hedef proteine ​​göre değişir. Enjeksiyon, inkübasyon oosit sonra 3-7 Ringer Çözüm gün (90 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MOPS, 2 mM CaCl 2, pH 7.4) ve 18 az 1 mg / ml gentamisin ° C karanlık 8. 6. Site özel Floresan Etiketleme Ölçümü öncesinde, 45 dakika yükleme tamponu (110 mM NaCl, 2.5 mM sodyum sitrat, pH 7.4 ve 10 mM MOPS / Tris) ve 45 dakika sonrası yükleme tamponu (100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 oosit inkübe 5 mM BaCl 2, 5 mM NiCl 2, pH 7.4), 10 mM MOPS / Tris intraselüler Na + konsantrasyonu 14 artırmak . Floresans ölçümleri için, istenilen fluorofor [eski 5 mcM içeren bir yükleme sonrası tampon inkübe oosit. tetramethylrhodamine-6-maleimide (TMRM) ya da floresein-5-maleimide (FM)] 5-10 dakika. Fluorofor etiketleme sonra, boya sonrası yükleme tamponu 3 ince ayrıntısına kadar oosit yıkayın. 7. Elektrofizyoloji Borosilikat (1B150F-4, Dünya Hassas Aletler) mikropipet çektirmesi (Model PC-10, Narishige) kullanarak çekerek Mikroelektronlar olun. 3 M KCl ile elektrotlar doldurun ve dayanıklılık testi. Direnci M 15 0.5-1.5 arasında olmalıdır. 535DF50 eksitasyon filtresi, 565 EFLP emisyon filtresi ve sistein tarama deneyler için bir 570DRLP dikroik ayna (Omega Optik) ile floresan mikroskobu (Carl Zeiss, Axio Examiner Floresan Mikroskobu) donatın. Floresan mikroskop sahnede RC-10 odası (Warner Instruments) oosit yerleştirin ve yavaşça, oosit içine fabrikasyon elektrotlar yerleştirin. Turbo Tec-05X amplifikatör (NPI Elektronik) kullanarak, sabit bir değer membran potansiyeli tutun ve membran aşağıdaki çözüm döviz üzerinden veya membran potansiyeli değiştirerek iyon akı ölçmek. Eşzamanlı floresan ölçümleri için, donör fluorofor ve floresan yoğunluğu değişiklikleri belirlemek için bir PIN-022A fotodiyot (Birleşik Dedektör Teknolojileri) heyecanlandırmak için 100 W tungsten ışık kaynağı kullanın. Her iki amplifikatör ve fotodiyot Digidata 1440A pCLAMP10 yazılım (Axon Instruments) veri toplama ve kayıt için kullanan bir bilgisayar ile veri toplama sistemi (Axon Instruments), üzerinden arabirim. Sistein tarama için, floresan değişimi pCLAMP 10 yazılımı (Moleküler Cihazlar) tarafından kontrol edilen sabit akım ile voltaj adımları ölçer. Ilgi membran proteini bağlı ekstraselüler çözüm sabit akım sağlamak için tasarlanmıştır. Hedeflenen protein fonksiyonel ölçümler floresan değişiklikleri ilişkilidir. 8. Anizotropi Ölçümler ve Mesafe Kısıtlamaları belirlenmesi. Anizotropi ölçümleri κ 2 değerleri aralığını hesaplamak için mesafe ölçümleri 8 ile birlikte alınmalıdır . Anizotropi 16 rotasyon nedeniyle fluorofor göreli hareketlilik ölçer. Polarize filtreler (Linos Fotonik A.Ş.) kullanarak, FM veya ilgi amino asit artıkları polarize ışık TMRM aşağıdaki eksitasyon yaydığı paralel ve dik ışığı ölçer. Ölçümler çözüm değişim koşulları 8 ve fluorophores hareketliliğini belirlemek için sürekli membran potansiyeli altına alınır. Anizotropi r tarafından verilir = (I | |-I ⊥) / (| | + 2I ⊥) nerede | | paralel ışık yayılan ve ⊥ dik ışık 16 yayılır. Mesafe ölçümlerinde hata hesaplamak için, κ 2 max = 2 / 3 (1 + F rd + F ra + 3F rd * F ra) ve κ 2 dk = 2 / 3 (1 – (F rd + F ra) / 2 ) burada F rd = (r d / r o) 0.5 ve F ra = (r / r o) 0.5, r a r d TMRM, anizotropi FM anizotropi ve r o her fluorofor 8 temel anizotropi . Mesafe kısıtlamaları ölçmek için, iki erişilebilir ekstrasellüler sistein resid bir holoenzymeues. Oosit ölçümler sırasında sabit bir membran potansiyeli ve bu nedenle sürekli mesafe yapılacaktır olarak, floresan protein konformasyonel devletin bir fonksiyonu olarak bir değişiklik gerekmez. 1 mcM FM (alıcı fluorofor) ve karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde 4 mcM TMRM (donör fluorofor), ya da sadece 1 mcM FM içeren yazılan yükleme tamponu oosit inkübe edin. Bu fluorofor 8 ve bir alıcı olmadan etiketli holoenzymes için yapılacak ölçümler için olanak sağlar. Mikroskop 475DF40 eksitasyon filtresi, 530DF30 emisyon filtresi ve 505DRLP dikroik ayna ile donatın. Acceptor fluorofor varlığı ve yokluğu beyazlatma donör zaman bağımlılık ölçün. Bu ölçümlerin zaman seyri sırasında, çözüm akışı sürekli olmalıdır. Aksi takdirde, zaman içinde indüklenen bir ısı floresan artış görülebilir. Acceptor fluorofor olan ve olmayan photodestruction farkı iki artıkları arasındaki mesafe hesaplamak için kullanılır. Holoenzymes sadece donör fluorofor içeren bir alıcı fluorofor ile holoenzymes daha hızlı photodestruction oranı yaşayacaksınız. Verici ve alıcı fluorofor içeren Holoyenzymes yavaş photodestruction oranları birbirlerine 8 yakın sergileyecek. Ortalama, pClamp10 Clampex özelliği en az dört oosit kayıtları için donör fluorofor photodestruction sonuçlarını kullanarak. Sonuçların ortalaması alındıktan sonra, en uygun bir eğri elde etmek için bir üstel fonksiyon (monoexponential, biexponential) kullanın. En uygun eğri ile donör fluorofor photodestruction ve alıcısı olmadan zaman sabiti belirlemek için kullanılabilir. Denklemi ile verilen enerji transfer verimliliği E = 1-Γ DA / Γ D 17 GDA Γ D sadece donör fluorofor için sabit zaman anlamına gelir donör / acceptor fluorofor çifti ve sabit süre anlamına gelir . belirleyin Förster equation17 kullanarak, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), etiketli sistein kalıntıları arasındaki mesafe belirlenir; E verimliliği FRET, Ar-Verici ve alıcı fluorofor arasındaki mesafe, ve R o 17 eşleştirme donör ve alıcı için% 50 verimlilik mesafe. R o denklemi tarafından yönetilir R o = (9.7×10 3 JΦ D n -4 κ 2) J, donör emisyon ve alıcı emme normalize spektral örtüşme, Φ D bir alıcı fluorofor olmadan donör emisyon kuantum verimi , n kırılma indeksi ve κ 2 dipol-dipol etkileşimleri 8 için oryantasyon faktördür. 9 – Protein altbirimden Bağıl Hareket Alıcı ve donör fluorophores etiketli çift sistein yapıları kullanın. Bu deneyler için, iki sistein kalıntıları arasındaki mesafe ölçülür. Bu durumda, her bir kalıntı floresan protein 8 yapısal durumu aşağıdaki etiketleme bağımsız olmalıdır. Böylece, floresan rezonans enerji transferi herhangi bir değişiklik, donör ve alıcı fluorophores arasındaki mesafe bir değişiklik sonucu olacaktır. Mikroskop 475AF40 eksitasyon filtresi, 595AF60 emisyon filtresi ve 505DRLP dikroik ayna ile donatın. Bu deneyler için, bağışçı, heyecanlı ve acceptor fluorofor floresan ölçülür. Membran proteini aktive ve eş zamanlı olarak floresan değişimi ölçmek için uygun yöntemi (gerilim, ligand, çözüm değişimi) kullanın. Floresan yoğunluğunda bir artış, iki fluorophores ve böylece iki artıkları yakın birlikte hareket olduğunu gösterecektir. Floresan yoğunluğunda azalma, iki fluorophores ve böylece iki kalıntıları dışında daha hareketli olduğunu gösterir. Son olarak, floresan yoğunluğunda hiçbir değişiklik iki fluorophores ve böylece iki artıkları protein yapısındaki değişiklik üzerine aynı mesafede olduğunu göstermektedir. 10 Temsilcisi Sonuçlar Özel fluorophores ekstrasellüler sistein kalıntıları Etiketleme konformasyonel değişiklikler üzerine membran proteinlerinin hareketinin soruşturma sağlar. Şekil 1'de tipik bir gerilim kelepçe Florimetri eser gösterilir. Daha az su verme ortamı daha hidrofobik çevreye daha hidrofilik ya da daha fazla su verme fluorofor hareketi floresan yoğunluğu değişimi (düşük iz), çözüm döviz üzerine protein konformasyonel değiştirme (üst sonuçları iz). Bu teknik, mikolojik olabiliriki artıkları arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için ded. Bu tür deney sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir. Bir alıcı flurophore (kırmızı) varlığı, photobleaching bir alıcı fluorofor (siyah) olmadan daha yavaş gerçekleşir. Photobleaching oranı doğrudan Förster denklemi 17 göre iki fluorophores arasındaki mesafe ile ilgili. Tandem yapılan iki elektrot voltajı kelepçe deneyler tarafından doğrulanmadı gibi sonuçlar protein farklı yapısal durumları ile korele olabilir. Şekil 1 iyon transportu ve floresan değişiklikler Temsilcisi kayıt. Na + test çözümü ve 10 mcM ve 10 mM ouabain varlığı K + test çözümü varlığının en iyi, güncel kelepçe ölçümleri . Alt, mevcut kelepçe ölçümleri 3,8,19 ile birlikte ölçülen floresans yoğunluğu değişir. Şekil 2 Time Bağımlılığı Photobleaching. Donör photodestruction yokluğunda (siyah) ve alıcı fluorofor (kırmızı) varlığı ölçülür. Her eser, ortalama 4 oosit kayıtları.