Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

1. Expresión de la proteína Clon de la proteína de membrana de interés en un vector adecuado para la expresión de Xenopus laevis ovocito como pTLN 11 o pSG01MX 12. Vectores optimizados contienen 5 'y 3' Xenopus laevis globina β-regiones no traducidas 11,12, un sitio de restricción único, y un sitio promotor del ARN situado antes de los 5 'UTR 11. Estos componentes son necesarios para la óptima expresión en ovocitos, linearización del plásmido antes de la síntesis de ARNm y la síntesis de ARNm, respectivamente. 2. Cisteína mutación Un gráfico de Kyte-Doolittle se emplea para identificar los dominios transmembrana de la proteína que se hayan empleado la secuencia de la proteína de aminoácidos (ProtScale, ExPASy) 13. Los datos se muestran como la hidrofobicidad vs número de secuencia. Residuos que muestran valores positivos tienen más probabilidades de encontrarse en el dominio transmembrana. Utilizar este argumento para determinar los residuos más probable ubicado en la interfase entre los dominios transmembrana y extracelulares que se mutado a cisteína. Como la determinación de la interfaz del dominio transmembrana y en la región extracelular no se puede predecir con total certeza el uso de la parcela Kyte-Doolittle, es importante examinar una serie de residuos que se prevé que sea en la interfase. Esta región de la proteína es seleccionada para el movimiento previsto de la fluorophore.During un cambio conformacional, el fluoróforo se moverá entre un medio ambiente hidrofílicas e hidrofóbicas o entre un enfriamiento con agua más o menos el medio ambiente de agua de enfriamiento. Cada uno de estos cambios previstos en el medio ambiente tendrá como resultado un cambio en la intensidad de la fluorescencia. QuickChange mutagénesis dirigida Kit (Stratagene) se utiliza para generar un solo construye cisteína extracelular accesible. En síntesis, mezcla de 5 l de tampón de reacción 10X, 2 l de 5 ng / mL de ADN plásmido, 1,25 l cada una de 100 ng / mL adelante y cebador inverso, 1 l de dNTP (100 mM), y 39,5 l de bidestilada del agua. Por último, añadir 1 l de la ADN polimerasa PfuTurbo (Stratagene). Los cebadores utilizados para este paso debe ser diseñado con la mutación de un residuo de cisteína en la extracelular de interés. Programa de un termociclador con las siguientes especificaciones: 1 ciclo a 95 ° C durante 30 segundos, 12-18 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 1 minuto y 68 ° C durante 1 minuto por longitud kb del plásmido. La temperatura de hibridación (55 ° C) se calcula directamente de la temperatura de fusión de cada cebador. Un último paso se puede programar para mantener la temperatura a 4 º C si la reacción se lleva a cabo durante la noche. El número de ciclos depende de la mutación. Uso de 12 ciclos de mutaciones puntuales, 16 ciclos de un cambio de aminoácidos individuales, o ciclos de 18 años para múltiples inserciones de aminoácidos. Añadir 1 l de DpnI (New England Biolabs) a la mezcla de reacción, la mezcla con la pipeta, y se centrifuga (6000 rpm) durante 1 minuto. Incubar durante 1 hora a 37 ° C en un baño de agua. Descongele los 10 electro-células competentes (Invitrogen) en el hielo y se incuba estéril SOC medios de comunicación (20 mg / ml de triptona, 5 mg / ml de extracto de levadura, 1 mg / mL de NaCl, 0,4 mg / ml de KCl, 0,02 M de Mg 2 +, 0,02 M de glucosa, ddH2O) a 37 ° C hasta que se necesite. Alícuota de 20 l de las células en tubos de 1,5 ml de centrífuga y agregar 1 L de ADN digeridos a las células. Llene el celular del evaporador (Life Technologies) con agua helada, establezca la capacidad a 330 mF, velocidad de carga de rápido, y la resistencia a la tensión-Booster a 4 kW. Colocar 20 L de la solución de células / ADN en las células del evaporador cubetas. Coloque las cubetas en el celular del evaporador, cierre la tapa, conecte el cable de alimentación y gire el dial a la cubeta correcta. Ajuste la fuente de alimentación para cargar y mantener "arriba" hasta que la tensión se lee 430. Gire el dial para el brazo y el gatillo de prensa. Si hay un sonido de explosión, vuelva a intentar la electroporación. Pipeta de las células de la cubeta y transferirlos a 1,5 ml de SOC medios de comunicación. Incubar durante 1,5 horas a 37 ° C con agitación. Transferencia de 30 l de la solución de SOC / celular de LB / agar ampicilina (10 mg / mL de triptona, 5 mg / ml de extracto de levadura, 10 mg / mL de NaCl, 15 mg / ml de agar, ddH O 2 y 100 ampicilina ng / mL ). Propagación de las células en la placa e incubar la placa a 37 ° C durante la noche. Sola cosecha colonias de las placas y las culturas inocular 5 ml que contienen LB / ampicilina (10 mg / mL de triptona, 5 mg / ml de extracto de levadura, 10 mg / mL de NaCl, 100 ng / mL de ampicilina ddH2O) los medios de comunicación. Agite a 37 ° C durante 16-20 horas. Realizar una minipreparación ADN mediante el kit de Nucleospin plásmido (Macherey-Nagel). Cualitativamente examinar el producto por electroforesis en gel de agarosa. Quantitiate el rendimiento de ADN usando un espectrofotómetro Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Verificar la inserción de la mutación por secuenciación del ADN. <p class="Jove_title"> 3. Síntesis del ARNm Para alinear el ADN, digerir 3 mg de ADN plásmido en un volumen de 50 l de reacción de 5 l de amortiguación apropiada y una L de la enzima de restricción durante 1 hora a 37,0 ° C. Usando el alto el Producto PCR Purification Kit (Roche Applied Science), añadir 350 l de tampón de unión en el vial que digerir y agitar brevemente. Este kit se utiliza, ya que contiene guanidiniumisothiocyanate lo que hace que el tipo del producto de ARN. Lugar columnas de centrifugado en los tubos de recogida y carga de la columna con una solución de ADN digerir. Centrifugar a 18.000 g durante 20 segundos y descartar el filtrado. Añadir 500 l de tampón de lavado a la columna. Centrifugar 20 segundos a 18.000 g y deseche el flujo a través. Añadir 200 l de tampón de lavado a la columna. Centrifugar 30 segundos o hasta que la columna se seca a 18.000 g. Colocar la columna de giro en un autoclave 1,5 ml tubo de centrífuga y se añaden 50 l de agua tratada con DEPC a la columna. Elución por centrifugación durante 30 segundos a 18.000 g. Concentrar el ADN eluido de aproximadamente 15 l que se traduce en 0,5 mg en 3 l de solución. Elegir el correcto mMessage mMachine Kit (Ambion) de acuerdo con la secuencia del sitio del promotor en el ADN del plásmido (SP6, T7). Añadir 5 l 1 NTP-cap mezcla, 3 l de ADN lineal de la etapa anterior, un tampón de transcripción l, y 1 L de ARN polimerasa apropiada. Incubar durante 1,5-2 horas a 37 ° C. Añadir 12,5 l de LiCl de juego, 15 l de agua DEPC, en pocas palabras la mezcla (no vortex), se centrifuga a 11.000 g durante 10 segundos, y guardar a -20 ° C durante al menos 30 minutos de la precipitación. Pre-enfriar centrífuga a 4 ° C y centrifugar durante 15 minutos a toda velocidad después de la precipitación. Después de la centrifugación una bolita de color marrón debe ser visible en la parte inferior del tubo. Cuidadosamente y completamente separar el sobrenadante y añadir 150 ml de etanol al 70% de ARN grado enfrió a -20 º C. Se centrifuga a 4 ° C durante 5 minutos a toda velocidad. Eliminar el sobrenadante por completo, en pocas palabras secas (1-2 min) en un Eppendorf Vacufuge Además, y disolver el pellet ahora blanco en 12 l de agua DEPC. Quantitiate la producción de ARNm utilizando un Nanodrop 2000c espectrofotómetro (Thermo Scientific). 4. Eliminación de los ovocitos Este protocolo ha sido aprobado por animal de Atención Institucional de WPI y el empleo. Antes de la operación, la rana debe estar en ayunas durante 12 horas para evitar los vómitos durante la cirugía. Prepare una solución de 0.5 a 3.0 g MS-222 disuelto en agua. Agregar el bicarbonato de sodio hasta que la solución tiene un pH 7,0-8,0. MS-222 se utiliza como un anestésico para la rana durante la cirugía. Es importante usar guantes de nitrilo en todo momento durante la manipulación de MS-222 y la preparación de la solución en una campana química Sumerja la rana en la solución de MS-222 hasta que la rana ha perdido los reflejos de enderezamiento y los pies pellizco. Para comprobar la falta de respuesta, pellizcar la punta de la rana. Coloque la rana en la cara dorsal en el lado de una almohadilla absorbente pañal mojado. Esto evita el daño a la piel de la rana. Mantenga un papel toalla húmeda a la rana en todo momento, como la rana debe mantenerse húmeda durante toda la cirugía. Si los ojos de la rana está abierto, es importante para humedecerlos con suero fisiológico. Si la rana muestra signos de despertar, se vierte la solución anestésica en la rana y esperar hasta que la rana deja de responder. Realizar una pizca segundo dedo del pie antes de continuar el procedimiento. Haga una pequeña incisión celómico ya sea a la izquierda oa la derecha de la línea media de la rana. Las incisiones deben hacerse en la alternancia de los lados con las cirugías subsecuentes. Llevar el ovario hasta el exterior de la rana y extirpar el ovario. Evite tocar los ovarios a la piel de la rana. Si hay sangrado, aplique presión con un Q-tip estéril hasta que el sangrado se detenga. Sutura de la incisión con un patrón de sutura interrumpida con 3,0-4,0 material de sutura Vicryl Ethicon (Johnson & Johnson). Cuando la sutura, el uso de instrumentos quirúrgicos para atar un nudo a la vez y evitar el contacto con la piel de la rana. También es importante para suturar la celómico y las capas de la piel por separado. Esto es consistente con las directrices del NIH para huevos y captura de los ovocitos de Xenopus laevis (ver: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). Después de la cirugía, la rana no deben someterse a la operación por lo menos 2 meses. También se debe determinar si la rana está lo suficientemente sano como para someterse a cirugías posteriores. Un máximo de 6 cirugías se pueden realizar en cada una rana con la terminal de la cirugía 6 de bienestar. 5. Ovocito Defoculation y de inyección de ARNm El lóbulo de ovario aislados se divide con la tijera en partes más pequeñas. Los grupos se transfieren a una solución de Ringer + Ca 2 + con colagenasa (8,6g / L NaCl, 0,3 g / L KCl, y 0,33 g / l de CaCl 2). Agite suavemente la solución digerir durante 2 horas a 18 ° C. Si la mayoría de los ovocitos se separan, lavar ovocitos con solución de Ringer – Ca 2 + (8,6 g / L NaCl y KCl 0,3 g / L). Incubar los ovocitos durante diez minutos en solución de Ringer – Ca 2 +. La transferencia de ovocitos a la solución de Ringer + Ca 2 +. Inyectar los ovocitos con 25 ng de ARNm, en un volumen final de 50 nL con la Nanoject II Auto-Inyector nanolitros (Drummond), con 3,5 "tubos capilares Drummond. Nota: La cantidad de mRNA varía en función de la proteína diana. Después de la inyección, los ovocitos se incuban de 3-7 días en solución de Ringer (90 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MOPS, CaCl2 2 mM, pH 7,4) y 1 mg / ml de gentamicina a 18 ° C en la oscuridad 8. 6. Sitio específico fluorescencia de etiquetado Antes de la medición, incubar los ovocitos durante 45 minutos en tampón de carga (110 mM NaCl, 2,5 mM de citrato sódico y 10 mM MOPS / Tris a pH 7,4) y 45 min en tampón post-carga (100 mM NaCl, 1 mM CaCl 2, 5 mM BaCl 2, 5 mM NiCl2, y 10 mM MOPS / Tris a pH 7,4) para aumentar la concentración intracelular de Na + 14. Para medidas de fluorescencia, los ovocitos se incuban en un buffer de post-carga que consta de 5 M de la fluoróforo deseado [ex. tetrametilrodamina-6-maleimida (TMRM) o fluoresceína-5-maleimida (FM)] durante 5-10 minutos. Después de etiquetado fluoróforo, lavado de los ovocitos de forma exhaustiva con el tinte sin post-tampón de carga 3. 7. Electrofisiología Hacer microelectrodos tirando de borosilicato capilares (1B150F-4, Instrumentos del Mundo de Precisión) con un extractor micropipeta (modelo PC-10, Narishige). Rellene los electrodos con 3 M KCl y probar la resistencia. La resistencia debe ser entre 0.5 a 1.5 mW 15. Equipar el microscopio de fluorescencia (Carl Zeiss, Axio examinador microscopio de fluorescencia) con un filtro de excitación 535DF50, un 565 EFLP emisión de filtro, y un espejo dicroico 570DRLP (Omega óptica) para los experimentos de cisteína de exploración. Coloque el ovocito en una cámara RC-10 (Warner Instruments) en la platina del microscopio de fluorescencia y suavemente insertar los electrodos fabricados en el oocito. El uso de un Turbo Tec-05X amplificador (NPI Electronics), tienen el potencial de membrana en un valor constante y medir el flujo de iones a través de la membrana de intercambio de la siguiente solución o cambiando el potencial de membrana. Para medir la fluorescencia concurrentes, el uso de 100 W de tungsteno fuente de luz para excitar a los donantes fluoróforo y un fotodiodo PIN-022A (United Technologies Detector) para detectar cambios en la intensidad de la fluorescencia. Tanto el amplificador y un fotodiodo están interconectados, a través de un sistema de adquisición de datos Digidata 1440A (Axon Instruments), con un ordenador utilizando el software pCLAMP10 (Axon Instruments) para la adquisición y registro de datos. Para la digitalización de cisteína, medir el cambio en la intensidad de fluorescencia estacionaria en los pasos actuales de tensión con que son controlados por pCLAMP 10 software (Molecular Devices). En función de la proteína de la membrana de interés, la solución extracelular está diseñado para asegurar corriente estacionaria. Correlacionar los cambios en la intensidad de la fluorescencia de las medidas funcionales de la proteína objetivo. 8. Las mediciones de anisotropía y la determinación de restricciones de distancia. Mediciones de anisotropía se debe tomar junto con 8 medidas de distancia para calcular el rango de valores de κ 2. Anisotropía de las medidas de la movilidad relativa del fluoróforo debido a la rotación de 16. El uso de filtros polarizados (Linos Photonics Inc.), medir la luz paralela y perpendicular emitido por FM o excitación TMRM siguiente con la luz polarizada en los residuos de aminoácidos de interés. Las mediciones se toman en condiciones de intercambio solución 8 y el potencial de membrana constante para determinar la movilidad de los fluoróforos. Anisotropía está dado por r = (I | |-I ⊥) / (I | | + 2I ⊥) donde | | es el luminoso paralelo emitido y ⊥ es perpendicular a la luz emitida 16. Para calcular el error en las mediciones de distancia, κ 2 max = 2 / 3 (1 + F + F ª ra + 3F º F * ra) y κ 2 min = 2 / 3 (1 – (F + F ra ra) / 2 ), donde F º = (r d / r o) 0,5 y F = ra (r a / r o) 0,5; r es una anisotropía de TMRM, r d es la anisotropía de la FM, y r o es la anisotropía fundamental de cada fluoróforo 8 . Para medir las limitaciones de distancia, utilizar un holoenzyme que tiene dos resi accesible cisteína extracelularUES. Como los ovocitos se llevará a cabo en un potencial de membrana constante y por lo tanto, la distancia constante durante las mediciones, no tiene por qué ser un cambio de fluorescencia en función del estado de conformación de la proteína. Incubar los ovocitos en un tampón que contiene un mensaje de carga M FM (aceptor fluoróforo) y 4 TMRM M (fluoróforo donante) durante 30 minutos sobre el hielo en la oscuridad, o sólo un M FM. Esto permite realizar mediciones de holoenzimas etiquetados con y sin un aceptor fluoróforo 8. Equipar el microscopio con un filtro de excitación 475DF40, 530DF30 filtro de emisión, y un espejo dicroico 505DRLP. Medir la dependencia temporal de los donantes de blanqueo en presencia y ausencia del fluoróforo aceptor. Durante el curso temporal de estas medidas, el flujo de la solución debe ser continua. De lo contrario, un incremento de fluorescencia inducida por el calor a través del tiempo se pueden observar. La diferencia en fotodestrucción con y sin el fluoróforo aceptor se utiliza para calcular la distancia entre los dos residuos. Holoenzimas que contiene sólo el fluoróforo donante experimentará una tasa más rápida que fotodestrucción holoenzimas con un fluoróforo aceptor. Holoyenzymes que contiene a la vez donante y fluoróforo aceptor se exhiben bajas tasas fotodestrucción cuando en las proximidades de uno al otro 8. Utilizando la función de Clampex en pClamp10, el promedio de los resultados de la fotodestrucción de fluoróforo donantes durante un mínimo de cuatro grabaciones de los ovocitos. Una vez que los resultados han sido en promedio, el uso de una función exponencial (monoexponencial, biexponencial) para obtener una curva de mejor ajuste. La curva de mejor ajuste se puede utilizar para determinar la constante de tiempo para el fotodestrucción de donantes fluoróforo con y sin el aceptante. Determinar la eficiencia de la transferencia de energía dada por la ecuación E = 1-Γ DA / Γ D 17, en el GDA se refiere a la constante de tiempo para la pareja fluoróforo donador / receptor y Γ D se refiere a la constante de tiempo de sólo el fluoróforo donador. Utilizando el Förster equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), la distancia entre los residuos de cisteína etiquetados se puede determinar; E es la eficiencia de FRET, R es la distancia entre el donante y el fluoróforo aceptor, y es R o el 50% de eficiencia a distancia para el donante y el receptor emparejamiento 17. R o se rige por la ecuación R o = (9.7×10 3 JΦ D n -4 κ 2), donde J es la superposición normalizada del espectro de emisión y absorción de los donantes aceptor, Φ D es el rendimiento cuántico de la emisión de los donantes, sin un fluoróforo aceptor, n es el índice de refracción, y κ 2 es el factor de orientación de interacciones dipolo-dipolo 8. 9. El movimiento relativo de subunidades de la proteína Utilizar construcciones de doble cisteína, que están marcadas con fluoróforos aceptante y los donantes. Para estos experimentos, el cambio en la distancia entre los dos residuos de cisteína se medirá. Dado que este es el caso, el etiquetado de intensidad de fluorescencia en cada uno de los siguientes residuos debe ser independiente del estado de conformación de la proteína 8. Por lo tanto, cualquier cambio en la transferencia de energía de resonancia fluorescente será el resultado de un cambio de distancia entre el donante y el aceptor fluoróforos. Equipar el microscopio con un filtro de excitación 475AF40, 595AF60 filtro de emisión y un espejo dicroico 505DRLP. Para estos experimentos, el donante está muy contento y la fluorescencia del fluoróforo aceptor se mide. Utilice el método apropiado (tensión, ligando, solución de intercambio) para activar la proteína de la membrana y al mismo tiempo medir el cambio en la intensidad de la fluorescencia. Un aumento en la intensidad de fluorescencia indican que los dos fluoróforos y por lo tanto los residuos de dos se están moviendo más cerca. Una disminución en la intensidad de la fluorescencia se indica que los dos fluoróforos y por lo tanto los residuos de dos se están moviendo más separados. Por último, no hay cambio en la intensidad de fluorescencia indican que los dos fluoróforos y por lo tanto dos son los residuos a la misma distancia sobre el cambio en la conformación de la proteína. 10. Resultados representante Etiquetado de los residuos de cisteína extracelular con fluoróforos específicos permite la investigación de los movimientos de las proteínas de membrana de los cambios conformacionales. Una abrazadera de tensión típica traza fluorometría se muestra en la Figura 1. El cambio en la intensidad de fluorescencia (traza inferior), que es el movimiento del fluoróforo de una más hidrofílica que más ambiente hidrofóbico o de un enfriamiento en agua mayor a menor ambiente de enfriamiento con agua, los resultados de un cambio conformacional en la proteína en una solución de cambio (superior traza). Esta técnica puede ser extended para determinar restricciones de distancia entre dos residuos. Estos resultados experimentales se muestran en la Figura 2. En presencia de un aceptador de flurophore (rojo), photobleaching se produce a una tasa más lenta que sin un fluoróforo aceptor (negro). La tasa de photobleaching está directamente relacionada con la distancia entre dos fluoróforos de acuerdo con la ecuación de Förster 17. Estos resultados se pueden correlacionar con diferentes estados conformacionales de la proteína debe ser verificado por dos experimentos pinza electrodo de tensión realizadas a la par. Figura 1. Grabación Representante del transporte de iones y los cambios en la intensidad de la fluorescencia. Mediciones de la parte superior, pinza de corriente en presencia de una solución de Na + y K de prueba y solución de ensayo en presencia de 10 mM y 10 mM ouabaína. En pocas palabras, los cambios en la intensidad de fluorescencia se mide en conjunto con las mediciones de pinza de corriente 3,8,19. Figura 2. Dependencia del tiempo de photobleaching. Fotodestrucción donantes se mide en la ausencia (negro) y la presencia de aceptor fluoróforo (rojo). Cada traza es el promedio de cuatro grabaciones de los ovocitos.