막 단백질의 Conformational 역학 검사 현장에서 사이트 이동 형광 라벨링과

1. 단백질 표현 이러한 pTLN 11 pSG01MX 12 Xenopus laevis oocyte의 표현에 적합한 벡터로 관심의 막 단백질을 복제. 최적화된 벡터는 모두 5 '와 3'Xenopus laevis β – Globin 번역되지 않은 지역 11,12, 고유 제한 사이트와 5 'UTR 11 전에있는 RNA업자 사이트를 포함하고 있습니다. 이러한 구성 요소는 각각 최적의 oocytes 표현, mRNA 합성과 mRNA 합성하기 전에 플라스미드의 선형화, 필요합니다. 2. 시스테인 돌연변이 카이트 – 둘리틀 음모는 (ProtScale, ExPASy) 13 단백질의 아미노산 서열을 사용하여 대상 단백질의 transmembrane 도메인을 식별하는 고용됩니다. 데이터는 소수성 대 시퀀스 번호로 표시됩니다. 긍정적인 가치를 표시 잔류 가능성이 높습 transmembrane 도메인에서 찾을 수 있습니다. 시스테인으로 변이 될 transmembrane와 세포외 도메인 사이의 인터페이스에있는 가장 가능성 잔류물을 결정하기 위해이 계획을 사용합니다. transmembrane 도메인 및 세포외 영역의 인터페이스가 카이트 – 둘리틀 플롯을 사용하여 완전한 확신을 예측할 수없는 결정으로, 그것은 인터페이스에있을 것으로 예측 아르 잔류물의 범위를 검토​​하는 것이 중요합니다. 단백질의이 지역은 fluorophore.During conformational 변화의 예측 움직임에 대해 선택되어 형광단는 친수성과 소수성 환경 사이에 또​​는보다 물 담금질과 적은 물 담금질 환경 사이에서 이동합니다. 환경에서 이러한 예측 변화 각 형광 강도의 변화가 발생합니다. QuickChange 사이트 감독 돌연변이 유발 키트 (Stratagene)는 단일 extracellularly 접근 시스테인 구조를 생성하는 데 사용됩니다. 간단히, 10X 반응 완충액, 5 μL / NG 플라스미드 DNA 2 μL, 1.25 μL 100 μL / NG 앞으로 각 및 역방향 입문서, dNTP (100 ㎜) 1 μL, 두 번 증류의 39.5 μL 5 μL를 혼합 물. 마지막으로, PfuTurbo의 DNA를 중합 효소 (Stratagene) 1 μL를 추가합니다. 이 단계에 사용되는 primers은 관심의 세포 잔여물에 시스테인 돌연변이 설계되어야합니다. 프로그램은 다음 사양을 열 자전거 타는 사람 : 95 1주기 ° C 30 초, 30 초 동안 95 ° C에서 12-18 사이클, 1 분 및 68에 대한 55 ° C ° C 킬로바이트 플라스미드의 길이 당 1 분. 어닐링 온도 (55 ° C)이 각각 전처리 제의 용해 온도에서 직접 계산됩니다. 반응이 하룻밤 사이에 수행됩니다 ° C가있다면 마지막 단계 4에서 온도를 잡아 프로그래밍할 수 있습니다. 사이클의 개수는 돌연변이에 따라 달라집니다. 여러 아미노산 삽입에 대한 포인트 돌연변이, 하나의 아미노산 변화 16주기, 또는 18주기 12주기를 사용합니다. 반응 혼합물, pipetting으로 혼합하고, 1 분 원심 분리기 (6000 RPM)로 DpnI (뉴잉글랜드 Biolabs) 1 μL를 추가합니다. 37에서 1 시간 동안 품어 ° C 물을 욕조 인치 얼음 품어 살균 SOC 미디어 (20 MG / ML tryptone, 5 MG / ML 효모 추출물, 1 MG / ML NaCl, 0.4 MG / ML KCl, 0.02 M MG 2 +, 0.02에서 해동 상위 10 개 전자 관할 전지 (Invitrogen) 필요한 ° C까지 37 M 포도당, ddH2O). 나누어지는 20 1.5 ML의 원심 튜브에 세포의 μL 및 세포에 소화 DNA 1 μL를 추가합니다. 얼음물과 함께 휴대 Porator (생명 기술)를 기입, μF, 4 kΩ으로 전압 부스터에 충전 빨리 속도 및 저항 330에 정전 용량을 설정합니다. 셀 – porator cuvettes에 세포 / DNA 솔루션의 피펫 20 μL. 셀 – Porator에 cuvettes를 놓고, 뚜껑을 닫고 전원 코드를 연결하고 올바른 쿠베트에 다이얼을 설정합니다. 전압이 430까지 읽고 요금과 '을'보유하는 전원 공급 장치를 설정합니다. 팔 및 언론 트리거에 다이얼을 돌립니다. 터지는 소리가있다면, electroporation를 다시 시도합니다. 쿠베트에서 세포를 피펫 및 SOC 미디어 1.5 ML에게 전송할 수 있습니다. 37 1.5 시간 동안 품어 ° C 잡​​고. LB / 암피실린의 한천 플레이트 (10 MG / ML tryptone, 5 MG / ML 효모 추출물, 10 MG / ML NaCl, 15 MG / ML 한천, ddH 2 O 100 μL / NG 암피실린에 SOC / 세포 솔루션 30 μL를 전송 ). 접시에있는 세포를 펴고 ° C 야간 37 접시를 품어. 수확 한 접시에서 식민지 및 LB / 암피실린 (10 MG / ML tryptone, 5 MG / ML 효모 추출물, 10 MG / ML NaCl, 100 μL / NG 암피실린 ddH 2 O) 미디어를 포함하는 5 ML 문화의 예방. 37 흔들어 ° C를 16~20시간하십시오. Nucleospin 플라스미드 키트 (Macherey – 나겔)을 사용하여 DNA miniprep를 수행합니다. 질적 아가로 오스 겔 전기 영동하여 제품을 검사합니다. Nanodrop 2000c 분광 (써모 과학)를 사용하여 DNA의 수율을 Quantitiate. DNA 시퀀싱에 의해 돌연변이의 삽입을 확인합니다. <p class="jove_title"> 3. mRNA 합성 37.0 1 시간 5 μL 적절한 버퍼와 제한 효소 1 μL ° C.와 50 L의 반응 량의 DNA, 플라스미드 DNA의 다이제스트 3 μg을 linearize하기 하이 퓨어 PCR 제품 정화 키트 (로체 응용 과학)를 사용하여 다이제스트 약병과 소용돌이 간략 350 μL 바인딩 버퍼를 추가합니다. 이 제품 RNA 등급을하게 guanidiniumisothiocyanate가 들어 있으므로이 키트가 사용됩니다. 수집 튜브의 스핀 컬럼을 놓고 다이제스트 DNA 솔루션으로 컬럼을로드합니다. 20 초 동안 1만8천그램에서 원심 분리기와 흐름 -을 통해 폐기하십시오. 그 결과 해당 컬럼에 대한 세척 버퍼 500 μL를 추가합니다. 18,000그램 20 초 원심 분리기와를 통해 흐름을 폐기. 그 결과 해당 컬럼에 대한 세척 버퍼 200 μL를 추가합니다. 30 초 원심 분리기 또는 열의는 18,000에서 G. 건조까지 autoclaved 1.5 ML의 원심 분리기 튜브의 스핀 컬럼을 놓고 그 결과 해당 컬럼에 DEPC – 처리된 물 50 μL를 추가합니다. 18,000에서 30 초 동안 G.를 centrifuging하여 Elute 솔루션 3 μL의 0.5 μg 결과 약 15 μL에 eluted DNA를 집중. 플라스미드 DNA (SP6, T7)에 발기인 사이트 순서에 따라 올바른 mMessage mMachine 키트 (앰비온)를 선택합니다. 5 μL 1 NTP – 캡 믹스, 이전 단계에서 3 μL 선형 DNA 1 μL 전송 버퍼, 그리고 적절한 RNA 효소 1 μL를 추가합니다. 37 1.5-2 시간 동안 품어 ° C. 강수량에 대해 최소한 30 분 키트에서 LiCl의 12.5 μL, 15 μL DEPC 물, 믹스 간단히 (와동하지 않음), 10 초 동안 11,000그램에서 원심 분리기, 그리고 -20 ° C에서 저장소를 추가합니다. 4 미리 냉각 원심 분리기 ° C와 석출 후 최고 속도로 적어도 15 분 원심 분리기. 원심 분리 후 갈색 펠렛은 튜브의 하단에 표시되어야합니다. 조심스럽게 완전히 뜨는을 제거하고 -20 ° C.에 냉각 70% RNA 학년 에탄올 150 μL를 추가 최고 속도에서 5 분간 4 ° C에서 원심 분리기. Eppendorf Vacufuge 플러스에서 완전히 건조 잠시 뜨는 (1-2 분)을 제거하고, DEPC 물 12 μL에 지금 흰색 펠렛을 풀다. Nanodrop 2000c 분광 (써모 과학)를 사용하여 mRNA의 수율을 Quantitiate. 4. Oocyte 제거 이 프로토콜은 WPI의 기관 애니멀 케어 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다. 이전 작업으로, 개구리는 수술 중에 구토를 방지하기 위해 12 시간 동안 금식해야합니다. 물속에 녹아있는 0.5-3.0 g MS – 222의 솔루션을 확인하십시오. 솔루션 산도 7.0-8.0을 때까지 나트륨 중탄산염를 추가합니다. MS – 222은 수술하는 동안 개구리를위한 마취로 사용됩니다. MS – 222을 처리하는 동안 항상 nitrile 장갑을 착용하고 화학 후드 아래에있는 솔루션을 준비하는 것이 중요하다 개구리는 righting 및 발가락 핀치 반사를 잃어 때까지 MS – 222 솔루션에 개구리를 잠그다. 응답하지 않는 문제를 확인하려면, 개구리의 발가락을 꼬집어. 젖은 기저귀 패드의 흡수 측면 등의 측면에서 개구리를 놓습니다. 이것은 개구리의 피부에 손상을 방지합니다. 개구리가 수술 내내 습한 보관해야합니다으로 젖은 종이 타월 가까이 항상 개구리에 보관하십시오. 개구리의 눈을 뜨고있다면, 그것은 생리 식염수와 함께 그들을 축축하게하다하는 것이 중요합니다. 개구리는 각성의 징후를 보여주는 경우, 개구리에 마취 솔루션을 붓다와 개구리는 응답 될 때까지 기다립니다. 절차를 계속하기 전에 두 번째 발가락 핀치를 수행합니다. 개구리의 정중선의 왼쪽이나 오른쪽 중 하나에 작은 coelomic 절개를합니다. Incisions는 이후 수술과 측면을 번갈아에하여야한다. 개구리의 외관에 난소를 지참하고 난소를 제거합니다. 개구리의 피부에 난소를 만지고 마십시오. 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지, 멸균 면봉을 넣었와 압력을 적용합니다. 3.0-4.0 Ethicon Vicryl의 봉합 재료 (존슨 앤 존슨)으로 중단 봉합 패턴을 사용하여 절개를 봉합. suturing 때, 한 번에 하나의 매듭과 개구리의 피부를 만지고 피하기 위해 수술 도구를 사용합니다. 별도 coelomic 및 피부 레이어를 치료하는 것도 중요하다. 이것은 Xenopus laevis oocyte에서 계란의 수확에 대한 NIH 가이드라인 (보고와 일치 http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). 수술 후, 개구리는 최소 2 개월 수술을하지 않아야합니다. 개구리는 이후 수술을 받아야 할만큼 건강에있다​​면 그것은 또한 결정되어야합니다. 6 수술의 최대 6 일 수술을 받고 터미널 각 개구리에서 수행할 수 있습니다. 5. Oocyte의 Defoculation 및 mRNA 사출 절연 난소 엽은 작은 부분으로 가위로 나뉘어져 있습니다. 대단히 짧은 시간은 링어의 솔루션 collagenase와 + 칼슘 2 + (8.6로 전송됩니다G / L NaCl, 0.3 g / L KCl, 그리고 0.33 g / L CaCl 2). 부드럽게 18 ° C. 2 시간에 대한 다이제스트 솔루션을 흔들 칼슘 2 + (8.6 g / L NaCl 및 0.3 g / L KCl) – 대부분의 oocytes를 분리하는 경우, 링어의 솔루션 oocytes 씻는다. 링어의 솔루션이 10 분에 대한 oocytes를 품어 – 칼슘 2 +. 링어의 솔루션 + 칼슘 2 +로 oocytes를 전송합니다. . 3.5 "드루먼드 모세관 튜브 참고로, Nanoject II 자동 Nanoliter 주입기 (드루먼드)과 함께 50 NL의 최종 볼륨에서 mRNA 25 NG와 oocytes를 주사 : mRNA의 양은 대상 단백질에 따라 다릅니다. 사출, 부화 후 3-7 oocytes 링어의 솔루션 일 (90 MM NaCl, 2 MM KCl, 5 MM 걸레 2 MM CaCl 2, 산도 7.4) 18 1 MG / ML gentamycin ° C 어둠 8인치 6. 사이트 특정 형광 라벨 이전 측정하려면, 로딩 버퍼에 45 분 (110 MM NaCl, pH를 7.4에서 2.5 MM 나트륨 구연 산염, 10 MM 걸레 / 트리스) 및 사후 로딩 버퍼 45 분 (100 MM NaCl, 1 ㎜ CaCl 2 oocytes을 품어 5 MM BaCl 2, 5 MM NiCl 2, 산도 7.4) 10 MM 걸레 / 트리스는 세포내 나 + 농도 14 증가합니다. 형광 측정, 원하는 형광단 [예 5 μm의를 포함하는 포스트 로딩 버퍼에 품어 oocytes. tetramethylrhodamine – 6 – maleimide (TMRM) 또는 플루오레신 – 5 – maleimide (FM)] 50-10분하십시오. 형광단 라벨 후, 염료 무료 사후 로딩 버퍼 3 철저하게 oocytes 씻으십시오. 7. 전기 생리학 micropipette 풀러 (모델 PC – 10, Narishige)를 사용 borosilicate 모세 혈관 (1B150F – 4, 세계 정밀 계측기)를 당겨 microelectrodes하십시오. 3 M KCl로 전극을 입력하고 저항을 테스트합니다. 저항 MΩ 15 0.5-1.5 사이 여야합니다. 535DF50 여기 필터, 565 EFLP 배출 필터, 그리고 시스테인 스캔 실험 570DRLP 이색성 거울 (오메가 광학)과 형광 현미경 (칼 자이스 혈구, Axio 심사관 형광 현미경)을 장비. 형광 현미경 무대에서 RC – 10 실 (워너 인 스트 루먼트)에서 oocyte를 삽입하고 부드럽게 oocyte로 가공 전극을 삽입합니다. 터보 테크 – 05X 증폭기 (NPI 전자)를 사용하여 상수 값을에서 막 잠재력을 보유하고 막 다음과 같은 솔루션을 통해 교환이나 막 잠재력을 변경하여 이온 플럭스를 측정합니다. 동시 형광 측정은 기증자 형광단과 형광 강도의 변화를 감지하기 위해 PIN – 022A photodiode를 (미국 탐지기 기술) 자극 100 W 텅스텐 광원을 사용합니다. 앰프와 photodiode 모두 데이터 수집 및 녹화를위한 pCLAMP10 소프트웨어 (액슨 악기)를 이용한 컴퓨터와 함께 Digidata 1440A 데이터 수집 시스템 (액슨 인 스트 루먼트)를 통해, 인터페이스입니다. 시스테인 스캔, pCLAMP 10 소프트웨어 (분자 장치)에 의해 제어되는 고정 전류 사용 전압 단계에서 형광 강도의 변화를 측정합니다. 관심의 막 단백질에 따라 세포 솔루션 정지 전류를 보장하기 위해 설계되었습니다. 대상 단백질의 기능 측정 형광 강도의 변화를 상관 관계. 8. 이방성 측정 및 거리 제약의 결정. 이방성 측정은 κ이 값의 범위를 계산하기 위해 거리 측정 8과 함께 이동해야합니다. 이방성 회전 16 때문에 형광단의 상대 이동성을 측정합니다. 편광 필터 (Linos Photonics 주식 회사)를 사용, FM 또는 관심있는 아미노산 잔류물에 편광과 TMRM 다음 여기에서 나오는 평행 및 직각 빛을 측정합니다. 측정은 솔루션 교환 조건 8 fluorophores의 이동성을 결정하는 상수 막 잠재력에 따라 이동됩니다. 이방성가 R에 의해 주어진다 = (I | | – 나 ⊥) / (I | | + 2I ⊥) 어디에 | | 병렬 빛이 방출하며 본인이 ⊥ 수직 빛이 16 방출합니다. 거리 측정에 오류를 계산하려면, κ이 최대 = 3분의 2 (1 + F 차 + F 라스 + 3F 차 * F RA) 및 κ 2 분 = 3분의 2 (1 – (F 차 + F RA) / 2 ) 어디 F 차 = (R D / R O) 0.5와 F 라 = (R / R O) 0.5, R입니다 TMRM의 이방성은 R D는 FM의 이방성이며, R O 각 형광단 8 근본적인 이방성입니다 . 거리의 제약을 측정하기 위해 두 개의 접근 세포 시스테인 resid을 가진 holoenzyme를 사용하여ues. oocytes가 측정 중에 일정 막 잠재력 따라서 일정한 거리에서 개최됩니다로서, 단백질의 conformational 상태의 함수로 형광 변화가있을 필요가 없습니다. 1 μm의 FM (수용체 형광단)와 어두운 얼음 속에서 30 분 동안 4 μm의의 TMRM (기증자 형광단), 또는 단 1 μm의 FM을 포함 게시 로딩 버퍼에 oocytes를 품어. 이것은 형광단 8과 수용체없이 표시 holoenzymes 위해 만든 것으로 측정 있습니다. 475DF40 여기 필터, 530DF30 배출 필터 및 505DRLP 이색성 거울과 현미경을 장비. 수용체의 형광단의 존재와 부재의 표백 기증자의 시간 의존성을 측정합니다. 이러한 측정의 시간 과정, 솔루션 흐름은 지속되어야합니다. 그렇지 않으면, 시간이 지남에 형광 증가를 유도 가열은 관찰 수 있습니다. 수용체의 형광단와없는 photodestruction의 차이는 두 잔류물 사이의 거리를 계산하는 데 사용됩니다. 오직 기증자 형광단를 포함 Holoenzymes는 수용체의 형광단와 holoenzymes보다 빠른 photodestruction 속도를 경험하게됩니다. 기증자와 수용체의 형광단 모두를 포함하는 Holoyenzymes 느린 photodestruction 속도 때 다른 8 가까이에 전시됩니다. 평균, pClamp10에서 Clampex 기능을 사 oocyte 레코딩의 최소 기증자 형광단의 photodestruction의 결과를 사용합니다. 결과가 평균되었습니다되면, 가장 적합한의 곡선을 얻기 위해 지수 함수 (monoexponential, biexponential)을 사용합니다. 가장 적합의 곡선이 함께 기증 형광단의 photodestruction과 수용체없이 시간 상수를 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 방정식에 의해 주어진다 에너지 전송 효율 E = 1 – Γ DA / Γ GDA는 Γ D에만 기증 형광단에 대한 상수 시간을 말합니다 기증자 / 수용체 형광단 쌍과에 대한 지속 시간을 의미 D 17.을 결정 포스터 equation17를 사용하여, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R O 6), 표시 시스테인 잔류물 사이의 거리가 결정 수 있으며, E는 효율성을 안달이고, R은 기증자와 수용체의 형광단 사이의 거리이며, R O는 17 페어링 기증자와 수용체에 대한 50 %의 효율 거리. R O는 방정식에 의거하여 R O = (9.7×10 3 JΦ D N -4 κ 2) 어디에 J는 기증자의 방출 및 수용체 흡수의 표준 스펙트럼 중복이고, Φ D 수용체의 형광단없이 기증자 방출의 양자 수율입니다 n은 굴절의 인덱스이며, κ 2 쌍극자 – 쌍극자 상호 작용 8 방향 요소입니다. 9. 단백질 Subunits의 상대 운동 수용체와 기증자 fluorophores으로 표시 아르 더블 시스테인 구조를 사용합니다. 이러한 실험의 경우, 두 시스테인 잔류물 사이의 거리의 변화가 측정됩니다. 이 경우이기 때문에, 각각의 잔여물에서 형광 강도 다음과 라벨은 단백질 8 conformational 국가의 독립해야합니다. 따라서, 형광 공명 에너지 전달의 모든 변경 사항은 기증자와 수용체의 fluorophores 사이의 거리의 변화의 결과 것입니다. 475AF40 여기 필터, 595AF60 방출 필터 및 505DRLP 이색성 거울과 현미경을 장비. 이러한 실험은 기증자가 흥분되고 수용체의 형광단의 형광이 측정됩니다. 막 단백질을 활성화하고 동시에 형광 강도의 변화를 측정하는 적절한 방법 (전압, 리간드, 솔루션 교환)를 사용합니다. 형광 강도의 증가는 두 fluorophores 때문에이 잔류물 가까이 함께 움직이는 것을 나타냅니다. 형광 강도의 감소는 두 fluorophores 때문에이 잔류물이 떨어져 더 움직이는 것을 나타냅니다. 마지막으로, 형광 강도의 변화는 두 fluorophores 때문에이 잔류물은 단백질의 형태의 변화에​​ 따라 동일한 거리에있는 것으로 표시되지 않습니다. 10. 대표 결과 특정 fluorophores와 세포외 시스테인 잔류물을 라벨링하는 conformational 변화에 따라 막 단백질의 움직임을 조사 수 있습니다. 전형적인 전압 클램프 fluorometry 추적은 그림 1에 표시됩니다. 적은 물 담금질 환경에 더 많은 소수성 환경에보다 친수성 ​​또는보다 물 담금질에서 형광단의 움직임이다 형광 강도의 변화 (로우어 트레이스), 용액 교환시 단백질의 conformational 변화 (어퍼 결과에서 추적). 이 기술은 엑스턴 수 있습니다이 잔류물 사이의 거리 제한을 결정 됐나요. 이러한 실험 결과는 그림 2에 표시됩니다. 수용체의 flurophore (적색)의 존재에서, photobleaching이 수용체의 형광단 (블랙)하지 않고보다 느린 속도로 발생합니다. photobleaching의 속도는 직접 포스터 방정식 17에 따라 두 fluorophores 사이의 거리에 관련이 있습니다. 탠덤에서 수행한 두 전극 전압 클램프 실험에 의해 검증과 같은 결과는 단백질의 다른 conformational 미국에 상호하실 수 있습니다. 그림 1. 이온 수송 및 형광 강도의 변화 대표 녹화. 나 + 테스트 솔루션 및 10 μm의 10 MM의 ouabain의 존재에 K + 테스트 솔루션의 면전에서 위로, 현재 클램프 측정. 바텀, 전류 클램프 측정 3,8,19 창출하는 측정 개화 강도의 변화. 그림 2.의 시간 의존성은 Photobleaching. 기증자 photodestruction은 부재 (검정) 및 수용체 형광단 (적색)의 면전에서 측정됩니다. 각 추적 4 oocyte 레코딩의 평균입니다.