Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

1. Eiwitexpressie Kloon het membraan eiwit van belang in een vector die geschikt zijn voor Xenopus laevis oöcyt uitdrukkingen zoals pTLN 11 of pSG01MX 12. Geoptimaliseerd vectoren bevatten zowel de 5 'en 3' Xenopus laevis β-globine onvertaalde regio's 11,12, een unieke restrictie site, en een RNA-promotor site gelegen voor de 5 'UTR 11. Deze componenten zijn nodig voor een optimale expressie in eicellen, linearisatie van het plasmide voor de mRNA-synthese en mRNA-synthese, respectievelijk. 2. Cysteine ​​Mutatie Een Kyte-Doolittle plot wordt gebruikt om de transmembraan domeinen van de beoogde eiwit te identificeren met behulp van het eiwit van de aminozuursequentie (ProtScale, ExPASy) 13. De gegevens worden weergegeven als hydrofobiciteit versus volgnummer. Residuen die positieve waarden weer te geven zijn waarschijnlijk te vinden in de transmembraan domein. Gebruik dit complot om de meest waarschijnlijke resten zich op het grensvlak tussen de transmembraan-en extracellulaire domeinen die zullen worden gemuteerd naar cysteïne te bepalen. Het bepalen van de interface van de transmembraan domein en extracellulaire regio kunnen niet voorspeld worden met volledige zekerheid via de Kyte-Doolittle plot, is het belangrijk om te onderzoeken een reeks van residuen die zijn naar verwachting in de interface. Deze regio van het eiwit is geselecteerd voor de voorspelde beweging van de fluorophore.During een conformationele verandering, zal de fluorofoor bewegen tussen een hydrofiele en hydrofobe omgeving of tussen een meer water afschrikken en minder water afschrikken omgeving. Elk van deze voorspelde veranderingen in de omgeving zal leiden tot een verandering in de fluorescentie-intensiteit. QuickChange plaatsgerichte mutagenese Kit (Stratagene) wordt gebruikt om een ​​extracellulair cysteïne toegankelijk constructies te genereren. In het kort, mix 5 ul 10X reactiebuffer, 2 pi van 5 ng / ul plasmide DNA, 1,25 pi elk van de 100 ng / ul forward en reverse primer, 1 ul van dNTP (100 mm) en 39,5 ul van dubbel gedestilleerd het water. Voeg ten slotte 1 ul van PfuTurbo DNA-polymerase (Stratagene). De primers die voor deze stap moet worden ontworpen met de cysteine ​​mutatie op een extracellulaire residu van belang. Programma een thermal cycler aan de volgende specificaties: een cyclus op 95 ° C gedurende 30 seconden, 12-18 cycli bij 95 ° C gedurende 30 seconden, 55 ° C gedurende 1 minuut en 68 ° C gedurende 1 minuut per kb plasmide lengte. De annealing temperatuur (55 ° C) wordt direct berekend op basis van de smelttemperatuur van elke primer. Een laatste stap kan worden geprogrammeerd om de temperatuur te houden bij 4 ° C als de reactie wordt 's nachts uitgevoerd. Het aantal cycli hangt af van de mutatie. Gebruik 12 cycli voor puntmutaties, 16 cycli voor een enkele aminozuur verandering, of 18 cycli voor meerdere aminozuur inserties. Voeg 1 ul van DpnI (New England Biolabs) aan het reactiemengsel, meng door pipetteren, en wordt gecentrifugeerd (6000 rpm) gedurende 1 minuut. Incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C in een waterbad. Dooi top 10 electro-competente cellen (Invitrogen) op ijs en incubeer steriele SOC-media (20 mg / ml trypton, 5 mg / ml gistextract, 1 mg / ml NaCl, 0,4 mg / ml KCl, 0,02 M Mg 2 +, 0,02 M glucose, ddH2O) bij 37 ° C totdat het nodig is. Aliquot 20 pi van cellen in 1,5 ml centrifugebuizen en voeg 1 pi van verteerd DNA van de cellen. Vul de Cell-Porator (Life Technologies) met ijswater, stelt u de capaciteit tot 330 uF, laadstroom te vasten, en de weerstand van de spanning-Booster tot 4 kΩ. Pipetteer 20 pi van de cel / DNA-oplossing in cell-porator cuvetten. Plaats de cuvetten in de Cell-Porator, sluit het deksel, sluit het netsnoer, en draai de draaiknop om de juiste cuvette. Zet de voeding op te laden en te houden 'omhoog' totdat de spanning leest 430. Draai de draaiknop om arm en druk op activeren. Als er een knallend geluid, opnieuw de elektroporatie. Pipetteer de cellen van de cuvette en overbrengen naar 1,5 ml SOC media. Incubeer gedurende 1,5 uur bij 37 ° C met schudden. Overdracht 30 pi van de SOC / cel oplossing voor LB / ampicilline agar platen (10 mg / ml trypton, 5 mg / ml gistextract, 10 mg / ml NaCl, 15 mg / ml agar, DDH 2 O en 100 ng / ul ampicilline ). Spreid de cellen op de plaat en incubeer de plaat bij 37 ° C gedurende de nacht. Oogst enkele kolonies van de platen-en enten 5 ml kweken die LB / ampicilline (10 mg / ml trypton, 5 mg / ml gistextract, 10 mg / ml NaCl, 100 ng / ul ampicilline DDH 2 O) media. Schudden bij 37 ° C gedurende 16-20 uur. Voer een DNA Miniprep met behulp van de Nucleospin Plasmide kit (Macherey-Nagel). Kwalitatief onderzoek van het product door agarose gelelektroforese. Quantitiate de opbrengst van DNA met behulp van een Nanodrop 2000c Spectrofotometer (Thermo Scientific). Controleer of het inbrengen van de mutatie door DNA-sequencing. <p class="Jove_title"> 3. mRNA Synthese Aan het DNA, te verteren 3 ug van plasmide DNA lineariseren in 50 L reactie volume met 5 ul juiste buffer en een pi van restrictie-enzym gedurende 1 uur bij 37,0 ° C. Met behulp van de High-Pure PCR-product Purification Kit (Roche Applied Science), voeg 350 ul binding buffer naar de verteren flacon en vortex kort. Deze kit wordt gebruikt als het bevat guanidiniumisothiocyanate waarin het product RNA-kwaliteit maakt. Plaats spin-kolommen in de collectie van buizen en laad de kolom met verteren DNA-oplossing. Centrifugeer bij 18.000 g gedurende 20 seconden en gooi flow-through. Voeg 500 ul van wasbuffer aan de kolom. Centrifugeer 20 seconden bij 18.000 g en gooi doorstromen. Voeg 200 ul van wasbuffer aan de kolom. Centrifuge 30 seconden of totdat kolom is droog bij 18000 g. Plaats de spin kolom in een autoclaaf 1,5 ml centrifugebuis en voeg 50 ul van DEPC behandelde water naar de kolom. Elueer door centrifugeren gedurende 30 seconden bij 18000 g. Concentreer de geëlueerde DNA op ongeveer 15 pl, wat resulteert in 0,5 ug in 3 pi oplossing. Kies de juiste mMessage mMachine Kit (Ambion) volgens de promoter website volgorde in het plasmide DNA (SP6, T7). Voeg 5 ul een NTP-cap mix, 3 pL gelineariseerde DNA van de vorige stap, een pL transcriptie buffer, en een pi van geschikte RNA-polymerase. Incubeer 1,5-2 uur bij 37 ° C. Voeg 12,5 ul van LiCl van kit, 15 uL DEPC water, meng kort (niet vortex), centrifugeer bij 11.000 g gedurende 10 seconden, en bewaar bij -20 ° C gedurende ten minste 30 minuten voor de neerslag. Pre-cool centrifuge tot 4 ° C en centrifugeer gedurende 15 minuten op volle snelheid na neerslag. Na het centrifugeren een bruine pellet zichtbaar moet zijn op de bodem van de buis. Zorgvuldig en volledig de bovenstaande vloeistof en voeg 150 ul van 70% ethanol RNA graad afgekoeld tot -20 ° C. Centrifugeer bij 4 ° C gedurende 5 minuten op volle snelheid. Verwijder de bovenstaande vloeistof volledig, kort droog (1-2 min) in een Eppendorf Vacufuge Plus, en los van de nu wit pellet in 12 ul DEPC water. Quantitiate de opbrengst van mRNA met behulp van een Nanodrop 2000c Spectrofotometer (Thermo Scientific). 4. Eicel verwijderen Dit protocol is goedgekeurd door Institutional Animal Care WPI's en gebruik Comite. Voor het gebruik, moet de kikker zijn vasten gedurende 12 uur om braken te voorkomen tijdens de operatie. Maak een oplossing van 0.5-3.0 g MS-222 opgelost in water. Voeg sodium bicarbonaat tot de oplossing heeft een pH van 7,0-8,0. MS-222 wordt gebruikt als verdovingsmiddel voor de kikker tijdens de operatie. Het is belangrijk om nitril handschoenen te dragen te allen tijde bij het behandelen van MS-222 en de oplossing voor te bereiden in een chemische motorkap Dompel de kikker in de MS-222-oplossing totdat de kikker heeft verloren opricht en teen knijpen reflexen. Om te controleren bewusteloosheid, knijp de teen van de kikker. Plaats de kikker op de dorsale zijde van de absorberende zijde van een natte luier pad. Dit voorkomt schade aan de huid van de kikker. Houd een vochtig papieren handdoek dicht bij de kikker te allen tijde, als de kikker moet vochtig worden gehouden in de hele operatie. Als de ogen van de kikker zijn open, is het belangrijk om ze te bevochtigen met een fysiologische zoutoplossing. Als de kikker tekenen van ontwaken, giet de verdoving oplossing op de kikker en wacht tot de kikker niet meer reageert. Voer een tweede teen knijpen voor de voortzetting van de procedure. Maak een klein coelomic incisie aan de linker-of rechterkant van midline de kikker. Incisies moeten worden gemaakt op wisselstroom zijden met latere ingrepen. Breng de eierstok aan de buitenkant van de kikker en verwijder de eierstok. Vermijd het aanraken van de eierstokken om de huid van de kikker. Als bloeden optreedt, druk uit te oefenen met een steriele Q-tip totdat het bloeden stopt. Suture de incisie met behulp van een onderbroken hechtdraad patroon met 3.0-4.0 Ethicon Vicryl hechtmateriaal (Johnson & Johnson). Bij het hechten, gebruik chirurgische instrumenten om een ​​knoop in een tijd en het aanraken van de huid van de kikker te voorkomen. Het is ook belangrijk om de coelomic en de huid lagen apart hechtdraad. Dit is consistent met de NIH richtlijnen voor ei-en eicellen oogsten in Xenopus laevis (zie: http://oacu.od.nih.gov/arac/XenopusOocyte_101007_Fnl.pdf ). Na de operatie moet de kikker niet ondergaan de werking gedurende ten minste 2 maanden. Het moet ook worden vastgesteld of de kikker is gezond genoeg om de volgende operaties te ondergaan. Er kunnen maximaal 6 operaties kunnen worden uitgevoerd op elke kikker met het 6e operatie wordt terminal. 5. Eicel Defoculation en mRNA Injection De geïsoleerde ovariële kwab is verdeeld met een schaar in kleinere delen. De klompjes worden overgebracht in Ringer's + Ca 2 + met collagenase (8,6g / L NaCl, 0,3 g / L KCl, en 0,33 g / L CaCl 2). Schud de digest-oplossing gedurende 2 uur bij 18 ° C. Als de meeste eicellen worden van elkaar gescheiden, wassen eicellen met Ringer's – Ca 2 + (8,6 g / L NaCl en 0,3 g / L KCl). Incubeer eicellen tien minuten in Ringer-oplossing – Ca 2 +. Overdracht eicellen te Ringer's + Ca 2 +. Injecteren eicellen met 25 ng van mRNA, in een uiteindelijk volume van 50 nL met de Nanoject II Auto-Injector nanoliter (Drummond), met 3,5 "Drummond capillaire buizen. Opmerking: De hoeveelheid mRNA is afhankelijk van het doelwit eiwit. Na injectie, incubeer eicellen 3-7 dagen in Ringer-oplossing (90 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MOPS, 2 mM CaCl2, pH 7,4) en 1 mg / ml gentamycine bij 18 ° C in het donker 8. 6. Site-specifieke fluorescentie Etikettering Vóór de meting, incubeer eicellen gedurende 45 minuten bij het ​​laden buffer (110 mM NaCl, 2,5 mM natriumcitraat, en 10 mM MOPS / Tris bij pH 7,4) en 45 min in post-loading buffer (100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM BaCl 2, 5 mM NICL 2, en 10 mM MOPS / Tris bij pH 7,4) om de intracellulaire Na + concentratie 14 te verhogen. Voor fluorescentie metingen incuberen eicellen in een post-loading buffer die 5 pM van het gewenste fluorofoor [ex bevat. tetramethylrhodamine-6-maleïmide (TMRM) of fluoresceïne-5-maleïmide (FM)] gedurende 5-10 minuten. Na fluorofoor etikettering, uitvoerig wassen van de eicellen met kleurstof-free post-laadbuffer 3. 7. Elektrofysiologie Maak micro-elektroden door aan boorsilicaat haarvaten (1B150F-4, World precisie-instrumenten) met behulp van een micropipet trekker (Model PC-10, Narishige). Vul de elektroden met 3 M KCl en test de weerstand. De weerstand moet tussen 0,5-1,5 MΩ 15. Rust de fluorescentie microscoop (Carl Zeiss, Axio Examiner fluorescentiemicroscoop) met een 535DF50 excitatie filter, een 565 EFLP emissie-filter, en een 570DRLP dichroïde spiegel (Omega Optical) voor het scannen van cysteïne experimenten. Plaats de eicel in een RC-10 kamer (Warner Instruments) op de fluorescentie microscoop podium en voorzichtig de gefabriceerd elektroden te voegen in de eicel. Met behulp van een Turbo Tec-05X versterker (NPI Electronics), houd de membraanpotentiaal op een constante waarde en meet de ionen flux over het membraan volgende oplossing beurs of door het veranderen van de membraanpotentiaal. Voor gelijktijdige fluorescentie meten, gebruik dan een 100 W gloeilamp bron naar de donor fluorofoor en een PIN-022A fotodiode (United Detector Technologies) om veranderingen te detecteren in fluorescentie-intensiteit te wekken. Zowel de versterker en de fotodiode zijn interface, via een Digidata 1440A data-acquisitiesysteem (Axon Instruments), met een computer gebruik te maken van pCLAMP10 software (Axon Instruments) voor data-acquisitie en het opnemen. Voor cysteïne het scannen, het meten van de verandering in de fluorescentie-intensiteit bij stationaire stroom met spanning stappen die worden aangestuurd door pCLAMP 10 software (Molecular Devices). Afhankelijk van het membraan eiwit van belang, is de extracellulaire oplossing die is ontworpen om stationaire stroom te verzekeren. Correleren veranderingen in fluorescentie-intensiteit van functionele metingen van de beoogde eiwit. 8. Anisotropie Metingen en Bepaling van de afstand Constraints. Anisotropie metingen moeten worden genomen naast de afstandsmetingen 8 tot en met het bereik van κ twee waarden te berekenen. Anisotropie meet de relatieve mobiliteit van de fluorofoor door rotatie 16. Met behulp van gepolariseerde filters (Linos Photonics Inc), het meten van de parallelle en loodrechte licht dat wordt uitgezonden door FM of TMRM na excitatie met gepolariseerd licht op aminozuur residuen van belang. De metingen worden genomen in het kader oplossing uitwisseling voorwaarden 8 en een constante membraanpotentiaal om de mobiliteit van de fluoroforen te bepalen. Anisotropie wordt gegeven door r = (I | |-I ⊥) / (I | | + 2I ⊥) waar ik | | is de parallelle licht uitgezonden en ik ⊥ is de loodrechte licht uitgezonden 16. De fout in afstandsmetingen te berekenen, κ 2 max = 2 / 3 (1 + F + F rd ra + 3F rd * F ra) en κ 2 min = 2 / 3 (1 – (F RD + F ra) / 2 ) waarin F rd = (r d / r o) 0.5 en F ra = (r a / r o) 0,5; r een is anisotropie van TMRM, r d is anisotropie van FM, en r o is fundamenteel anisotropie van elke fluorofoor 8 . Voor het meten van afstanden beperkingen, gebruik maken van een holoenzyme die twee toegankelijk extracellulair cysteïne resid heeftUES. Als de eicellen zal worden gehouden op een constante membraanpotentiaal en dus constante afstand tijdens de metingen, is er niet nodig om een ​​fluorescentie-verandering als een functie van de conformationele toestand van het eiwit te zijn. Incubeer de eicellen in de post het laden van een buffer met 1 uM FM (acceptor fluorofoor) en 4 uM TMRM (donor fluorofoor) gedurende 30 minuten op ijs in het donker, of slechts 1 uM FM. Dit zorgt voor metingen kunnen worden verricht voor de holoenzymen gelabeld met en zonder een acceptor fluorofoor 8. Rust de microscoop met een 475DF40 excitatiefilter, 530DF30 emissie-filter, en 505DRLP dichroïde spiegel. Meet de tijd afhankelijkheid van donor bleken in de aanwezigheid en afwezigheid van de acceptor fluorofoor. Gedurende het tijdsverloop van deze metingen moet oplossing stromen continu zijn. Anders kan een warmte-geïnduceerde fluorescentie toenemen loop van de tijd in acht worden genomen. Het verschil in photodestruction met en zonder de acceptor fluorofoor wordt gebruikt om de afstand tussen de twee residu te berekenen. Holoenzymen die alleen de donor fluorofoor ervaart een sneller tempo dan photodestruction holoenzymen met een acceptor fluorofoor. Holoyenzymes die zowel een donor en acceptor fluorofoor zal vertonen langzaam photodestruction tarieven wanneer in de nabijheid van een ander 8. Met behulp van de Clampex functie in pClamp10, de resultaten van de photodestruction van de donor fluorofoor voor een minimum van vier eicel opnames gemiddelde. Zodra de resultaten zijn gemiddeld, gebruik maken van een exponentiële functie (monoexponential, bi-exponentiële) om een ​​curve van de beste fit te krijgen. De curve van de beste pasvorm kan worden gebruikt om de tijd constant te bepalen voor de photodestruction van de donor fluorofoor met en zonder de acceptor. Bepalen de efficiëntie van de energie-overdracht gegeven door de vergelijking E = 1-Γ DA / Γ D 17, waar de GDA verwijst naar de tijd constante voor de donor / acceptor fluorofoor paar en Γ D verwijst naar de tijd constante voor alleen de donor fluorofoor. Met behulp van de Förster equation17, E = 1 / (1 ​​+ R 6 / R o 6), de afstand tussen het label cysteïneresiduen kan worden bepaald; E is de FRET efficiëntie, R is de afstand tussen donor en acceptor fluorofoor, en R o is de 50% rendement afstand voor de donor en acceptor koppelen 17. R o wordt beheerst door de vergelijking R o = (9.7×10 3 JΦ D n -4 κ 2), waar J is de genormaliseerde spectrale overlap van de donor-emissie en acceptor absorptie, Φ D is de quantum opbrengst van donor-emissie, zonder een acceptor fluorofoor, n is de brekingsindex, en κ 2 is de oriëntatie factor voor dipool-dipool interacties tussen 8. 9. Relatieve beweging van eiwitsubeenheden Gebruik dubbele cysteine ​​constructen die zijn voorzien van acceptor en donor fluoroforen. Voor deze experimenten, zal de verandering in afstand tussen de twee cysteïne-residuen worden gemeten. Aangezien dit het geval is, moeten de fluorescentie-intensiteit volgende etikettering op elk residu onafhankelijk zijn van de conformationele toestand van het eiwit 8. Zo zal elke verandering in de fluorescentie resonantie energie-overdracht het gevolg zijn van een verandering van de afstand tussen de donor en acceptor fluoroforen. Rust de microscoop met een 475AF40 excitatiefilter, 595AF60 emissie-filter en 505DRLP dichroïde spiegel. Voor deze experimenten, is de donor opgewonden en de fluorescentie van de acceptor fluorofoor wordt gemeten. Gebruik de juiste methode (spanning, ligand, oplossing exchange) aan het membraan eiwit te activeren en gelijktijdig meten van de verandering in de fluorescentie-intensiteit. Een toename van de fluorescentie-intensiteit geeft aan dat de twee fluoroforen en dus twee residuen zijn dichter bij elkaar bewegen. Een afname van de fluorescentie-intensiteit geeft aan dat de twee fluoroforen en dus twee residuen zijn verder uit elkaar bewegen. Tot slot zal er geen verandering in de fluorescentie-intensiteit geven aan dat de twee fluoroforen en dus twee resten worden op dezelfde afstand bij de verandering in de conformatie van het eiwit. 10. Representatieve resultaten Etikettering extracellulaire cysteïneresiduen met specifieke fluoroforen maakt het onderzoek naar de beweging van membraaneiwitten op conformationele veranderingen. Een typische spanning klem fluorometrie trace is weergegeven in figuur 1. De verandering in de fluorescentie-intensiteit (onderste spoor), die de beweging van de fluorofoor van een meer hydrofiel tot meer hydrofobe omgeving of vanuit een meer water afschrikken om minder water quenching omgeving, de resultaten van een conformationele verandering in het eiwit bij de oplossing uitwisseling (bovenste trace). Deze techniek kan uitbreiDED om de afstand tussen twee beperkingen residuen vast te stellen. Dergelijke experimentele resultaten zijn weergegeven in figuur 2. In de aanwezigheid van een acceptor flurophore (rood), fotobleken vindt plaats op een trager tempo dan zonder een acceptor fluorofoor (zwart). De snelheid van fotobleken is direct gerelateerd aan de afstand tussen twee fluoroforen volgens de Förster vergelijking 17. Dergelijke resultaten kunnen worden gecorreleerd aan verschillende conformationele toestanden van het eiwit zoals gecontroleerd door twee elektroden voltage clamp experimenten uitgevoerd in tandem. Figuur 1. Vertegenwoordiger opname van ionen transport en veranderingen in fluorescentie-intensiteit. Top, stroomtang metingen in de aanwezigheid van Na + testoplossing en K + testoplossing in de aanwezigheid van 10 uM en 10 mM ouabain. Bodem, veranderingen in de bloei intensiteit gemeten in combinatie met stroomtang metingen 3,8,19. Figuur 2. Tijdsafhankelijkheid van Photobleaching. Donor photodestruction wordt gemeten in de afwezigheid (zwart) en de aanwezigheid van acceptor fluorofoor (rood). Elk spoor is het gemiddelde van de vier eicel opnamen.