Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex
Summary
Dies ist ein Protokoll zu erstellen und Aufrechterhaltung eines Neokortex Scheibe Vorbereitung in organotypischen Kultur zum Zwecke der Herstellung elektrischer Aufnahmen von pyramidalen Neuronen.
Abstract
Wir haben die Untersuchung der Expression und funktionelle Rolle von spannungsabhängigen Kaliumkanälen in pyramidalen Neuronen von Ratten Neocortex. Wegen des Fehlens von spezifischen pharmakologischen Wirkstoffen für diese Kanäle, haben wir einen genetischen Ansatz zur Manipulation Kanal Ausdruck übernommen. Wir verwenden ein organotypischen Kultur Vorbereitung (16), um Zellmorphologie und der laminaren Muster der Hirnrinde zu halten. Wir in der Regel zu isolieren akuten neokortikalen Scheiben an postnatalen Tag 8-10 und halten die Scheiben in der Kultur für 3-7 Tage. Dies erlaubt uns, Neuronen in einem ähnlichen Alter wie in unserer Arbeit mit akuter Scheiben Studie und minimiert die Entwicklung von üppigen exzitatorischen Verbindungen in die Scheibe. Wir erfassen von visuell identifizierten Pyramidenneuronen in den Schichten II / III oder V mit Infrarot-Beleuchtung (IR-) und Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie (DIC) mit ganzen Zelle Patch-Clamp-in Strom-oder Spannungs-Klemme. Wir verwenden biolistischen (Gene gun) Transfektion von Wildtyp-oder mutierte Kaliumkanal DNA, um die Expression der Kanäle, um ihre Funktion zu untersuchen manipulieren. Die transfizierten Zellen werden leicht durch Epifluoreszenzmikroskopie nach Co-Transfektion mit cDNA für das grün fluoreszierende Protein (GFP) identifiziert. Wir vergleichen Aufnahmen von transfizierten Zellen zu benachbarten, nicht transfizierten Neuronen in der gleichen Schicht aus dem gleichen Stück.
Protocol
Discussion
Wir haben die Untersuchung der Expression und funktionelle Rolle von spannungsabhängigen Kaliumkanälen in pyramidalen Neuronen von Ratten Neokortex (4, 9-11). Wegen des Fehlens von spezifischen pharmakologischen Wirkstoffen für diese Kanäle, verwenden wir einen genetischen Ansatz zur Manipulation Kanal Ausdruck (1,14,15,17-19). Wir verwenden eine organotypischen Kultur Vorbereitung (2,3; 5-8; 12,13,15-22). Aus dem Ansatz der Stoppini et al (16) modifiziert, um Zellmorphologie und der laminaren Must…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Mayumi Sakuraba und Rebecca Foehring für hervorragende technische Unterstützung danken. Darüber hinaus möchten wir Drs danken. Rodrigo Andrade für die Unterstützung bei der Umsetzung der organotypischen Kultur und biolistischen Transfektion Protokolle und Dr. Jeanne Nerbonne für die Bereitstellung von cDNA-Konstrukte für die Transfektion. NS044163 aus NINDS (zu RCF): Diese Arbeit wurde vom NIH gefördert.
Materials
Surgery / transfection / culture:
- Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
- Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
- Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
- Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
- disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
- 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
- Tefzel Tubing: #165-2441
- Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984- 3766).
Media:
- Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
- HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
- 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
- Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
- 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)
Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.
Recording:
- Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
- Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
- Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
- lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
- Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
- IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).
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