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Neurociencias

네크로 텍스의 Organotypic 슬라이스 준비에서 전체 셀 녹음

Published: June 03, 2011
doi:
10.3791/2600
, , ,
1Department of Anatomy and Neurobiology,University of Tennessee Health Science Center

Summary

이것은 피라미드 뉴런에서 전기 레코딩을 만드는 목적 organotypic 문화 neocortical 슬라이스 준비를 준비하고 유지하는 프로토콜입니다.

Abstract

우리는 쥐 네크로 텍스의 피라미드 뉴런의 전압 – 문이 칼륨 채널의 표현과 기능적 역할을 공부했습니다. 때문에이 채널에 대한 특정 약리 대리인의 부족, 우리는 채널 표현을 조작하는 유전자 접근 방식을 촬영했습니다. 우리는 세포 형태학 및 피질의 판상 패턴을 유지하기 위해 organotypic 문화 준비 (16)를 사용합니다. 우리는 일반적으로 출생 후의 일 8-10에서 급성 neocortical 조각을 분리하고 3~7일에 대한 문화의 슬라이스를 유지합니다. 이것은 우리가 급성 슬라이스와 함께 우리의 일을 사람들에게 비슷한 나이에 신경을 공부 수 있으며 통에 풍부한 흥분성의 연결의 개발을 최소화합니다. 우리는 전류 또는 전압 클램프의 전체 세포 패치 클램프와 함께 적외선 조명 (IR -)와 차동 간섭 대비 현미경 (DIC)를 사용하여 레이어 II / III 또는 V에서 시각 식별 피라미드 뉴런에서 기록합니다. 우리는 그들의 기능을 연구하기 위해 채널의 표현을 조작하는 야생 형식이나 돌연변이 칼륨 채널의 DNA biolistic (진 총) transfection을 사용합니다. transfected 세포는 쉽게 녹색 형광 단백질 (GFP)의 cDNA와 함께 공동 transfection 후 epifluorescence 현미경으로 식별됩니다. 우리는 동일한 슬라이스에서 동일한 레이어에 인접해 untransfected 뉴런에 transfected 세포의 음반을 비교합니다.

Protocol

1. 칼자국의 하루 전에 준비 우리는 수술 악기 압력솥 사전 깔끔히의 하루 솔루션을 준비하는보다 효율적입니다 찾습니다. 압력솥 악기. (수술과 깔끔히가 반 무균 조건 하에서 수행됩니다.) 개별적 압력솥 종이에 싼 다음과 같은 패키지를 압력솥 : 수술 패키지 주걱, # 22 메스 블레이드 핸들, 가위, 집게 깔끔히 패키지 :</stron…

Discussion

우리는 쥐를 네크로 텍스 (4, 9-11)에서 피라미드 뉴런의 전압 – 문이 칼륨 채널의 표현과 기능적 역할을 공부했습니다. 때문에이 채널에 대한 특정 약리 대리인의 부족, 우리는 채널 표현 (1,14,15,17-19)를 조작을위한 유전자 접근 방법을 사용합니다. 세포 형태학 및 피질의 판상 패턴을 유지하기 위해 Stoppini 외 (16)의 접근에서 수정. 우리는 organotypic 문화 준비 (12,13,15-22,, 5-8 2,3) 활용. 우?…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자는 뛰어난 기술 지원을 마유미 Sakuraba과 레베카 Foehring 감사하고 싶습니다. 또한, 우리는 DRS 감사하고 싶습니다. transfection에 대한 cDNA 구성으로 우리를 제공할 organotypic 슬라이스 문화와 biolistic transfection 프로토콜 및 박사 진 Nerbonne 구현에 도움을 로드리고 안드레 이드. NINDS (RCF)를에서 NS044163 :이 작품은 NIH 교부금에 의해 지원되었다.

Materials

Surgery / transfection / culture:

  1. Brain Slicer: Campden Vibroslice #MA572 World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
  2. Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547)
    • Includes: Gene gun, helium hose assembly with regulator, tubing prep station (#165-2418), syringe kit, Tefzel tubing, tubing cutter, optimization kit (#165-2424), tubing cutter
    • Bio-Rad Helium Regulator (#165-2413)
    • disposable supplies for Helios from Bio-Rad:
      • 1.6 μm Gold Microcarriers: #165-2264
      • Tefzel Tubing: #165-2441
  3. Incubator: Forma Scientific model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984- 3766).

Media:

  1. Horse Serum: Hyclone donor equine #SH 30074. (HyClone, 925 West 1800 South, Logan, UT 84321)
  2. HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS and HEPES, no glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog #12-137F): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  3. HBSS (GIBCO Hanks buffered saline, #24020-117): GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  4. MEM (GIBCO minimal essential medium, #12360-038), GIBCO/INVITROGEN, (800) 955- 6288, Option 1.
  5. 250 mL Millipore 0.2 μm filter: #SC6PU02RE
  6. Plastic Transfer pipettes: Fisher #13-711-20.
  7. 50 mL Millipore steriflip 0.22 μm filter (#SCGP00525)

Items 6-8 obtained from: Fisher Scientific, 1241 Ambassador Blvd, P.O. Box 14989, St. Louis, MO 63132.

Recording:

  1. Pipet glass: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatus, 84 October Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746
  2. Sutter P-87 horizontal electrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949
  3. Axon Instruments Multiclamp 700B amplifier: Molecular Devices, Inc. 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  4. PClamp 10 data acquisition software: Molecular Devices, Inc., 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089-1136
  5. lectrode position is controlled with Sutter ROE-200 manipulators and PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949.
  6. Microscope: Olympus BX-50WI upright microscope with IR-DIC optics
  7. IR-sensitive camera OLY-150 (Olympus) or DAGE-MTI (DAGE-MTI, 01 North Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360).
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Referencias

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Whole Cell RecordingOrganotypic Slice PreparationNeocortexVoltage-gated Potassium ChannelsPyramidal NeuronsGenetic ApproachOrganotypic Culture PreparationLaminar Pattern Of CortexAcute Neocortical SlicesVisually-identified Pyramidal NeuronsInfrared IlluminationDifferential Interference Contrast MicroscopyWhole Cell Patch ClampCurrent-clampVoltage-clampBiolistic TransfectionWild Type Potassium Channel DNAMutant Potassium Channel DNAFunction StudyEpifluorescence MicroscopyGreen Fluorescent Protein (GFP)Adjacent Untransfected Neurons
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Citar este artículo
Foehring, R. C., Guan, D., Toleman, T., Cantrell, A. R. Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex. J. Vis. Exp. (52), e2600, doi:10.3791/2600 (2011).
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