세포 죽음의 정확한 평가에 대한 수정 Annexin V / Propidium 이우의 Apoptosis 분석
Summary
세포 죽음의 평가에 대한 정확한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 세포 라인과 동물 모델의 광범위한 범위에서 기본 세포 40 % 허위 – 긍정적인 이벤트까지 표시 기존 Annexin V / propidium 요오드화물 (PI) 프로토콜에 따라이 향상됩니다.
Abstract
세포 apoptosis의 연구는 크게 흐름 cytometry 기반 방법의 도입 이후 영향되었습니다. Propidium 요오드화물의 (PI)가 널리 세포가 플라즈마 막 무결성 및 투자율의 1,2의 차이를 통해 가능한, apoptotic 또는 괴사성 있는지 확인하기 위해 Annexin V와 함께 사용됩니다. Annexin V / PI 프로토콜은 apoptotic 세포에게 3 공부를 위해 일반적으로 사용되는 방법입니다. 그것이 세포가 4,5 생활 염료를 제외하기 위해 능력을 바탕으로, 경제적 안정과 세포 생존의 좋은 지표이기 때문에 PI는 더 자주 다른 핵 얼룩보다 사용됩니다. 셀 입력 PI의 능력은 막의 투자율에 의존적일 수, PI는 손상 플라즈마 막 1,2,6의 존재로 인해 거주하거나 초기 apoptotic 세포를 얼룩이되지 않습니다. 늦은 apoptotic 및 괴사성 세포에서 플라즈마와 핵 세포막의 무결성은 PI가 세포막을 통과 핵산에 사이에 끼어 넣다, 붉은 형광 1,2,9을 표시할 수 있도록, 7,8을 감소시킵니다. 불행히도, 우리는 그런 기존 Annexin V / PI 프로토콜은 세포질 구획 10 시간 RNA의 PI의 얼룩과 관련된 잘못된 긍정적인 사건의 상당수 (최대 40 %)에 리드 찾습니다. 가장 높은 발생 10보기 : (세포질 비율 <0.5 핵) 기본 세포와 동물 모델의 광범위한 셀 라인은 큰 세포와 영향을받습니다. 여기에, 우리는 기존의 방법에 비해 세포 죽음의 평가에 대한 상당한 개선을 제공하는 수정 Annexin V / PI 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 다음과 같은 얼룩 세포에 RNase의 진입을 촉진하기 위해 고정 셀 동안 세포 투과성의 변화에 활용합니다. 타이밍 및 RNase의 농도 모두 세포질 RNA의 제거를 위해 최적화되었습니다. 그 결과 종래의 Annexin V / PI 프로토콜 (세포질 PI의 얼룩과 <5 % 이벤트)을 통해 상당한 개선이다.
Protocol
Discussion
Annexin V / PI 프로토콜 여기서 제시하는 것은 기존 프로토콜의 수정된 버전이며 계정으로 또한 PI에 대한 높은 친화력을 가지고있는 세포질에서 RNA의 존재를 걸립니다. 얼룩 절차 후반 1 %의 포름 알데히드 고정 단계 다음 RNase (50 μg / ML)의 소개 원자력 PI의 얼룩의 정확도를 크게 향상시킵니다. 대한 부정적인 영향은 핵 PI의 얼룩이나 플라즈마 막 Annexin V의 얼룩에서 관찰되지 않습니다. RNase 치료없이 얼룩 PI 결과의 최대 40 %가 하류 결론 10 잠재적으로 중요하고 부정적인 영향에 이르게 거짓 긍정적인 행사로 이어질 수 있습니다.
우리 수정 Annexin V / PI 염색법 프로토콜은 간단하고 세포 유형 (기본 세포의 광범위한 범위에서 효과적으로 사용되었습니다 murine 골수 macrophages 및 splenocytes, 돼지 폐 재류 세포, 폐 폐포 macrophages, mesenteric 림프 노드 격리, 말초 혈액 leukocytes , splenocytes, 닭고기 배반엽 세포, 금붕어 기본 신장 macrophages, 잉어 말초 혈액 leukocytes, 셀 라인 : RAW 264.7 macrophages, Jurkat T 세포, 돼지 3D4/31 macrophages, CCL – 71 금붕어 지느러미 섬유아 세포, 3B11 메기의 B 세포 10). 세포가 differentially 차 전지는 일반적으로 잘못된 긍정적인 이벤트 10 큰 숫자를 가지고와 잘못된 긍정적인 PI의 얼룩에 의해 영향됩니다하는 것이 중요합니다. 이 세포 집단 간의 차이를 거짓 긍정적인 PI의 얼룩은 부분적으로 셀 크기의 차이로 표시될 수 있습니다뿐만 아니라 RNA 내용의 차이에서 발생할 수 있습니다. 이 절차의 예, 결합은 다른 사람 사이에 활용할 실험 시스템, genotoxic 스트레스를 겪고 세포, 세포주기 체포 등 thymidine 또는 hydroxyurea와 같은 약물, virally 감염된 세포 및 발달 진행 배아 세포 연구로 치료 세포에 특히 관련으로 세포 RNA 합성의 이산 변화이 특징입니다.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 자연 과학 및 캐나다 (NSERC) 연구 부여 공학 의회와 DRB하는 앨버타 농업 기금 컨소시엄 부여에 의해 지원되었다. AMR은 NSERC 베니 캐나다 대학원 장학금, 앨버타 교육 assistantship와 퀸 엘리자베스 II 대학원 장학금의 대학을 통해 지원됩니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 x PBS-/- | ||||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | ||
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes (Invitrogen) | A13201 | ||
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O | |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | ||
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | ||
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
Referencias
- Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V. J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).
- Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. Flow cytometry of apoptotic cell death. J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).
- Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation. Apoptosis. 7, 41-47 (2002).
- Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data. J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).
- Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented. Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).
- Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13, 795-808 (1992).
- Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis. Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).
- Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors. Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).
- Faleiro, L., Lazebnik, Y. Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier. J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).
- Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death. J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).
- Edward, R. Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells. Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).
- Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells. Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).
