Mevcut video, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bireysel nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme gerçekleştirmek için elektroporasyon ve konfokal mikroskopi kombinasyonu yararlanır bir yöntem gösteriyor.<em> In vivo</em> Önbeyin klonal bir seviyede nöral progenitör hücrelerin gelişimini analiz bu şekilde elde edilebilir.
Abstract
Bölünme, göç ve nöral progenitör hücrelerin farklılaşma hassas kalıpları, uygun bir beyin gelişimi ve işlevi 1,2 için çok önemlidir. In vivo ortamda karmaşık nöral progenitör hücrelerin davranışını anlamak için, sağlam bir beyin nöral progenitör hücrelerin zaman atlamalı canlı görüntüleme eleştirel gereklidir . Bu video, in vivo önbeyin nöral progenitör hücrelerin gelişimini görselleştirmek için zebrafish embriyoların benzersiz özellikleri istifade eder. Biz genetik ve seyrek etiket bireysel nöral progenitör hücrelerin elektroporasyon kullanın. Kısacası, DNA floresan belirteçler için kodlama yapıları, 22 saat sonra döllenme (hpf) zebrafish embriyolar ve elektrik bakliyat hemen teslim edildi önbeyin ventrikül içine enjekte edildi. Altı saat sonra, electroporated zebrafish embriyoların cam alt kültür yemekleri, düşük erime noktası agaroz ile monte edilmiştir. Floresan ile işaretlenmiş nöral progenitör hücreler daha sonra suya daldırma objektif lens kullanarak konfokal mikroskop altında sabit aralıklarla 36hours için görüntülenmiştir. Bu yöntemi, ön beyin nöral progenitör hücrelerin in vivo gelişiminde içgörüler kazanmak için bir yol sağlar ve Zebra balığı embriyonun merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerinde uygulanabilir .
Protocol
1. Zebra balığı Embriyolar hazırlanması Elektroporasyon İki gün önce, çiftleşme kafesleri ayrı kadınlarda erkeklere bölücüler kullanarak vahşi tip balık kurdu. Elektroporasyon bir gün önce, önceki günden itibaren kafeslerde çiftleşme bölücüler çekin. Embriyolar toplayın ve 28.5% 0.003 phenylthiourea (PTU) içeren 30 ml embriyonik orta ° C 50 döllenmiş embriyolar inkübe Elektroporasyon gününde, dechorionate elle embriyoların 22hpf gelişimsel aş…
Discussion
Bu video, zaman atlamalı, gelişmekte olan zebrafish önbeyin bir klonal düzeyde nöral progenitör hücrelerin canlı görüntüleme için bir yöntem ortaya koymaktadır. Biz genetik ve floresan etiket bireysel nöral progenitör hücrelerin test edilmiş ve mevcut elektroporasyon protokolleri 4-6 değiştirilmiş. Klonal olarak ilişkilidir döl hücrelerinin oluşan bir soy ağacı sadece birkaç hücre seyrek elektroporasyon göreceli düşük voltaj ile etiketlenmiş beri kurulabilir. EGFP ek olarak, …
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma theNIH grantNS042626 tarafından desteklenmiştir. Biz Kurt Thorn UCSF Nikon Görüntüleme merkezi ve görüntüleme ile yardım için teşekkür ederim.
Dong, Z., Wagle, M., Guo, S. Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain. J. Vis. Exp. (50), e2594, doi:10.3791/2594 (2011).