マイクロアレイ解析のためのサッカロマイセスセレビシエ</em
Summary
このプロトコルは、酵母の遺伝子発現（内<em>サッカロマイセスセレビシエ</em>）過酸化水素（Hの添加によって誘導される酸化ストレスへの曝露後に変更され<sub> 2</sub> O<sub> 2</sub>）、酸化剤。
Abstract
このプロトコルでは、酵母の遺伝子発現（ 出芽酵母 ） は、過酸化水素（H 2 O 2）、酸化剤の添加により誘導される酸化ストレスに暴露した後に変更されます。実験では、酵母は3Xグルコースを含む2分の1にYPD液体培地で48時間増殖されています。培養は、対照と投与群に分割されます。実験の文化を0.5mmハンクスのH 2 O 2で処理されること1時間（HBSS）緩衝生理食塩水。対照培養は、HBSSで扱われます。トータルRNAは、両方の文化から抽出され、多段階のプロセスを介してビオチン標識cRNAの製品に変換されます。最終的な合成製品は、UVMマイクロアレイの中核施設に戻って採取し、アフィメトリクスの酵母GeneChipsにハイブリダイズさせる。得られた遺伝子発現データは、バイオインフォマティクスデータ解析ソフトウェアにアップロードされます。
Protocol
<p class="jove_title"> 1。からトータルRNAを分離<em>サッカロマイセスセレビシエ</em>酵素溶解を使用して</p><ol><li>リボヌクレアーゼZAP（Ambion社）を用いてRNase – freeの作業ゾーンを準備します。</li><li> 10 U / ULの最終的な実用的なソリューションを作るためにlyticaseバイアルに直接RNaseフリー水1 mlを加えることによって新鮮な作業lyticaseの試薬を準備します。よくボルテックスして完全な混合を保証するために数回転倒。この10単位/μlのソリューションでは、12時間安定です。</li><li>氷の上でキアゲンのDNaseキットとストアを使用して新鮮なDNase I溶液を準備します。</li><li>あなたの識別情報1.7 mlのマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。チューブに適切な酵母の培養液1.5 mlを。</li><li>室温で2分間5000 × gで（約3 / 4フルスピード）でチューブを遠心分離します。慎重にマイクロピペットを用いて（妨害ペレットなし）上清を除去し、上清を捨てる。<strong>****ペレットのサイズが小さすぎる場合、またはインストラクターによって示される場合、手順4を繰り返します.****</strong</li><li>ペレット、渦、そして2分間5000 × gで遠心分離するために1000μlのDEPC水を加える。上清を捨てる。酵母ペレットからできるだけ液体をできるだけ多く削除します。</li><li>混在させる酵母ペレットとボルテックスに以下を追加します。<br /><table border="1"><tbody><tr><td> SGbuffer</td><td> 10μlの</td></tr><tr><td> Lyticasesolution（10u/μl）</td><td>30μlの</td></tr></tbody></table</li><li>室温で30分間インキュベートする。</li><li>静かに渦巻くチューブスフェロプラストを生成するために10分ごと。スフェロプラストを穏やかに処理する必要があります。完全なspheroplastingを観察する顕微鏡下で酵母を調べる。顕微鏡スライド上に酵母を調べるときに、酵母は完全な球体を（さらに出芽細胞用）膨潤とを形成させるために0.1％SDSを少量加える。これは、細胞壁が消化されていることを示しています。</li><li>管と渦に350μlのβ- RLTバッファーを追加します。<strong>精力的に</strong> 1分間。あなたのチューブがしっかりとボルテックスしながら蓋を閉じて保持することによっておおわれていることを確認します。この手順では、スフェロプラストを溶解されます。</li><li>チューブが少しの間ボルテックスに250μlの100％エタノールを加えます。沈殿物はエタノールの添加後、形成することがありますが、これはRNAのコレクションには影響しません。</li><li<strong> RNAの収集：</strong>ラベルあなたの同定とRNeasyスピンカラムには、マイクロピペットを用いてスピンカラムにステップ10からソリューションのすべてを転送する注意深くinformationand。ピペットチップでシリカメンブレンに触れないように注意してください。チューブを閉じて、フルスピードで15秒間遠心します。サンプル中のRNAは、スピンカラムのシリカメンブレンに従うことになります。</li><li>コレクションチューブからスピンカラムを削除します。ピペットは液体を通過（コレクションチューブに液体）バックスピンカラム上に、再度遠心する。コレクションチューブを捨てる（流体のフロースルー付き）と、新しい2 mlのコレクションチューブにスピンカラムを置きます。</li><li>スピンカラムに350μlのRW1バッファーを添加する。このソリューションは、RNAを洗浄し、塩と溶存細胞残渣を除去するために使用されます。チューブを閉じて、フルスピードで15秒間遠心します。</li><li<strong> DNAを消化する。</strong>、遠心分離機からスピンカラムを削除するチューブのふたを開いて、スピンカラムメンブレンの中央にDNase I溶液の80μlを加える。このステップは、サンプル内の任意のゲノムDNAを消化します。カラムの蓋を閉め、室温で15分間インキュベートする。</li><li>新しい2 mlのコレクションチューブにスピンカラムを転送。</li><li<strong>クリーニングとRNAを洗浄する。</strong>スピンカラムに350μlのRW1バッファーを加え、15秒間フルスピードで遠心分離。</li><li>コレクションチューブを廃棄し、新しい2 mlのコレクションチューブにスピンカラムを置きます。</li><li>シリカメンブレンにRNAを洗浄するためにスピンカラムに500μlのRPEバッファーを追加します。フルスピードで15秒間チューブと遠心分離機を閉じます<em>。</em</li><li>コレクションチューブを廃棄し、新しい2 mlのコレクションチューブにスピンカラムを置きます。</li><li>スピンカラムに別の500μlのRPEのバッファを追加することにより、再びシリカメンブレンを洗浄する。チューブを閉じて、フルスピードで15秒間遠心します。</li><li>任意の残液をシリカ膜から除去されるようにする1分間フルスピードで遠心機で新しい2 mlコレクションチューブと遠心分離機でスピンカラムをセット。</li><li<strong> RNAのリカバリ：</strong>あなたのサンプル情報で標識された新しい1.7ミリリットルの微量遠心チューブにRNeasyスピンカラムを転送。新しいチューブのキャップは、次のいくつかの手順のために開いたままにされることに注意してください。</li><li>静かにピペット30μlのRNaseフリー水<strong>直接センターへ</strong>シリカ膜の。<strong>ピペットチップでシリカメンブレンに触れないでください（図を参照）</strong>。この手順を実行するとよく見てください。ピペットを導くために、両手で行ってください。水が均等に細胞膜上に分布されていることを確認します。</li><li>室温で1分間スピンカラムをインキュベートする。 30秒間フルスピードで遠心する。</li><li>慎重に上記のステップ22と同じスピンカラムのシリカメンブレンの中央に戻し1.7ミリリットルチューブ中に回収されてから30μlを移す。同じ1.7ミリリットルのコレクションチューブに戻って列を配置し、室温で1分間インキュベートする。フルスピードで1分間遠心。この二重溶出は、RNAの最大量は、膜から回収されることを保証する。</li><li>ラベルして識別情報を持つ二つの新しい1.7ミリリットルマイクロチューブと、これらのチューブのいずれかに回収したRNAサンプルのすべてを譲渡する。</li><li>他の標識チューブにこのサンプルの4μlを。このサンプルは、光度計定量化し、RNA定性評価（これは、研究所の参加で、サイトで実行されたRNA定量と定性分析を検証することです）のためにUVMに戻って輸送されます。</li><li>氷の上ですべてのサンプルを置きます。</li><li<strong> RNAの定量：</strong>エッペンドルフ暗順応計を使用して、1〜50の希釈度で分光光度計でRNAサンプルの吸光度を測定（1μlのサンプル+49μlH<sub> 2</sub> O）。</li><li> E -ゲル（Invitrogen社）電気泳動の場合1.2％プレキャストアガロースゲルを用いてRNAの品質を評価する。</li><li<strong> RNA定性分析：</strong> E -ゲル電気泳動装置を設定します。メーカーの手順にしたがって2分間ゲルを事前に実行してください。プリ実行後、ゲルのコームを抜き取ると、うまく各ウェルに各サンプルの1μlのに続いて、それぞれに水14μlを加える。ピペッティングでよく混ぜる。 （私は標準またはNovagen社製のPCRマーカーのサイズを決定BioLine簡単ラダー）後でサイズの比較のためにもいずれかの適切なサイズのDNAのラダーを使用してください。各レーンになっているサンプル記録します。 20分間ゲルを実行します。</li><li>ゲルの写真を撮影。</li></ol><p class="jove_title"> 2。第一鎖cDNA合成</p><ol><li>あなたの識別情報と0.5ミリリットルのPCRチューブにラベルを付けます。上記の実験から決定されたRNAの濃度から、3.0 UGを取得するサンプルの体積を計算する。チューブにこの金額を譲渡する。 11.0 ULにボリュームをもたらすのに十分なRNaseフリー水を追加。</li><li> 1.0μLT7オリゴ（dT）を追加します。<sub> 24</subチューブへ>試薬。すべての試薬が転送されたことを確認するには、このステップ中にピペットチップの量には特に注意を払うようにしてください。渦を5秒間フルスピードでチューブと遠心分離機。 70で設定されたサーマルサイクラーにチューブを置く℃で10分間。</li><li> 70℃のインキュベーションが進んでいる間、新しいチューブに最初の鎖のマスターミックスを調製する。以下の試薬を追加してください<strong>ためには、</strong5秒と場所氷上でチューブをフルスピードで>ボルテックスと遠心。<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong>第一鎖のマスターミックス：</strong</td></tr><tr><td> FirstStrandBuffer5X</td><td> 4μL</td></tr><tr><td> 0.1MDTT</td><td> 2μL</td></tr><tr><td> 10mMdNTP</td><td> 1μL</td></tr><tr><td> SuperscriptII</td><td> 1μL</td></tr></tbody></table<br> 2μL以下の量を測定するためにP2のマイクロピペットを使用してください。</li><li> 70の後、手順2で℃のインキュベーションが完了すると、60分間42℃でサーマルサイクラーにチューブをインキュベートするステップ3で作成した第一鎖のマスターミックス8μlを加える。第一鎖合成のインキュベーションが終了したら、チューブを氷上に置きます。このインキュベーションの間、第二鎖のマスターミックスを調製する。</li></ol><p class="jove_title"> 3。第二鎖cDNA合成</p><ol><li>新しいチューブに以下の第二鎖のマスターミックスを行います。それは氷上に置きます。渦と使用する前に全ての試薬を軽く遠心する。記載された順に試薬を加える。<br /><table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"<strong>第二の鎖のマスターミックス</strong</td></tr><tr><td> DEPC水</td><td> 91 UL</td></tr><tr><td> 5Xセカンドストランドバッファー</td><td> 30 UL</td></tr><tr><td>のdNTP（10mMの）</td><td> 3 UL</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNAリガーゼ（10U/ul）</td><td> 1 UL</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em> DNAポリメラーゼI（10U/ul）</td><td> 4 UL</td></tr><tr><td<em> Ecoli</em>リボヌクレアーゼH（2U/ul）</td><td> 1 UL</td></tr></tbody></table</li><li>ボルテックスフルスピードで5秒のためのチューブと遠心分離機。</li><li> 42℃のインキュベーションが終了すると、RNAおよび第一の鎖の試薬を含む試料管に第二鎖のマスターミックスのすべての130μlを移す。室温で5秒間ボルテックスし、遠心。 16 ° Cのサーマルサイクラーでで2時間チューブをインキュベートします。</li><li> 2時間のインキュベーションの終了時に、サンプルは16℃にとどまっている間に、チューブに2μlのT4 DNAポリメラーゼの試薬を加える。簡潔にボルテックスし、せいぜい5追加分間16℃でチューブとインキュベートして遠心。長くて5分のインキュベートし、T4ポリメラーゼの3'5'exonuclease活動によるcDNAの品質が低下する場合があります。</li><li> 5分間のインキュベーションの終了時に、T4 DNAポリメラーゼの反応を停止するには10μlの0.5 M EDTAを加える。 -20℃でチューブを保存する</li></ol><p class="jove_title"> 4。 cDNAを沈殿させる</p><ol><li>ゲルは、チューブの底にできることを確認するには、1分間、フルスピードで位相ロックジェルチューブを遠心します。<strong> VORTEX位相ロックチューブはしないでください</strong>。</li><li> 162μlを加え<strong>最下層</strong> pHから8.0 -トリスは、内容を（上記の実験からのcDNA合成ステップの合計量混合して5秒間第二鎖cDNA合成の反応管と渦の内容にフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール（PCI）をバッファ162 ulのです。PCIのステップ）は、水性及び有機混合物の等容量を必要とする。</li><li>マイクロピペットを用いて位相ロックゲルチューブにcDNAを- PCI混合物のすべてを転送。<strong>ボルテックスは行なわないでください</strong>フェーズロックゲルチューブ。</li><li> 2分間、フルスピードで遠心分離。</li><li>新しい1.7ミリリットルの微量遠心チューブにラベルを付けます。位相ロックゲルチューブから新たにラベルの付いた1.7ミリリットルチューブに最上層を転送するためにマイクロピペットを使用してください。できるだけ層をできるだけ多く収集してみてください。</li><li> 1.7 mlの微量遠心管と渦に以下を追加します。<br /><table border="1"><tbody><tr><td>エタノール（100％）</td><td> 405 UL</td></tr><tr><td> NH<sub> 4</sub> OAC</td><td> 80 UL</td></tr><tr><td>ペレットペイント</td><td> 1 UL</td></tr></tbody></table</li><li>外を向いて、チューブのヒンジと遠心機でチューブを置き、室温で20分間フルスピードで遠心分離。</li><li>やさしくするcDNAペレットを乱さないように注意しながら遠心機からチューブを取り外します。ペレットはピンクになり、塩の粒のとヒンジの下にチューブの側面にほぼ同じサイズである。氷の上に置き、すぐに次のステップに進みます。</li></ol><p class="jove_title"> 5。のcDNAペレットの清掃</p><ol><li> P1000マイクロピペットを使用して、慎重にチューブから上清をすべて削除。ペレットを乱さないように注意してください。ペレットは、サンプルであることに注意してください！</li><li>500μL冷80％エタノール（-20に格納された追加<sup> ·</supチューブへ> C冷凍庫）。優しくチューブにキャップをし、ゆっくりと数回それを反転。非常に密接してペレットをご覧ください。ペレットが切り離さになれば、後ろのラックにチューブを配置し、ペレットが底に沈殿ができます。代わりに、チューブの底に戻ってダウンペレットを得るために15秒間フルスピードでチューブを遠心することがあります。</li><li> P1000マイクロピペットを使用して、慎重にペレットを乱さないように非常に注意してエタノールを除去します。できるだけ多くの液体の除去を有効にするためにチューブを傾ける。</li><li> 80％エタノールの新たなアリコートと手順2と3を繰り返します。</li><li>最後に、P1000マイクロピペットを用いて可能なエタノールのすべてを削除します。 5秒間フルスピードでチューブを遠心し、P20マイクロピペットを用いて、エタノールの最後の数マイクロリットルを削除します。目標は、ペレットを乱すことなく、できるだけ多くのエタノールとして削除することです。</li><li>残りのエタノールを蒸発させるために10〜20分のためのラックまたは乾燥ボックスで開いたチューブを置きます。それが乾燥している後に乾燥ペレットが簡単に失われます。軽くチューブを処理するBecareful。完了したら、キャップを閉じます。それは、チューブ内に存在を確認するために乾燥ペレットを可視化する。</li><li> RNaseフリー水22μlにペレットを再懸濁し、氷上でチューブを置く。</li></ol><p class="jove_title"> 6。 InVitroTranscription（IVT）</p><ol><li> ENZO bioarrayキットはcDNAからビオチン標識cRNAを準備するために必要なすべての試薬が含まれています。<br />マスターmixforクラス全体がfollows.Theインストラクターとして準備されるには、このミックスを準備するか、クラスの誰かを指名する。これは、RNaseフリーのエリアで行う必要があります。<br /><table border="1"><tbody><tr><td></td><td> AMT /サンプル</td><td>＃サンプル</td><td>合計</td></tr><tr><td>試薬1 [10 ×反応バッファー]</td><td>4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬2 [10倍Biotinnucleotides]</td><td>4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬3 [10倍DTT]</td><td>4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬4 [10倍のRNase阻害剤]</td><td>4μl</td><td></td><td></td></tr><tr><td>試薬5 [20倍のT7 RNAポリメラーゼ]</td><td>2μlの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>総量</td><td> 18μL</td><td></td><td></td></tr></tbody></table<br><strong>注：</strong>サンプルの数に1を加えた値のための十分なマスターミックスを調製する。これは、ピペッティングの目的のために十分な保証します。</li><li> 0.5ミリリットルのPCRチューブにラベルを付けます。上下ミックスを数回チューブに以下のとピペットを組み合わせる。チューブの底にすべての試薬を得るために5秒間フルスピードで遠心機でスピン。<br /><table border="1"><tbody><tr><td> cDNA混合物</td><td>22μl</td></tr><tr><td> Enzomastermix [fromabove]</td><td>18μl</td></tr><tr><td> TotalVolume</td><td>40μlの</td></tr></tbody></table</li><li> ° C for16時間クラーで37℃でチューブをインキュベートします。反応が完了すると、-20℃でサンプルを保存する</li></ol><p class="jove_title"> 7。ビオチン標識cRNAをクリーニング</p><ol><li>新しい1.7ミリリットルの微量遠心チューブに全体cRNAのサンプルを転送します。 RNaseフリー水60μlと5秒間350μlのRLTバッファーと渦を追加。</li><li>再び250μlの100％エタノールと渦を追加。</li><li> RNeasyスピンカラムにラベルを付けて列に全体のcRNAのサンプルを移す。シリカメンブレンにピペットの先端に触れないように注意してください。フルスピードで15秒間、蓋と遠心を閉じます。</li><li>コレクションチューブからスピンカラムを削除します。ピペットで15秒間再びスピンカラムや遠心上に液体（コレクションチューブに液体）を通過。</li><li>スピンカラムを新しい2 mlのコレクションチューブとピペットRPEバッファー500μlにスピンカラムをセット。チューブを閉じて、フルスピードで15秒間遠心します。コレクションチューブと液体の通過を捨てます。新しい2 mlのコレクションチューブにスピンカラムをセット。</li><li>スピンカラムに別の500μlのRPEバッファーを追加します。</li><li>新しいコレクションチューブにスピンカラムを移し、2分間、フルスピードでコラム"乾燥"スピンを実行します。</li><li>あなたの識別情報を持つ新しい1.7ミリリットルの微量遠心チューブにラベルを付けます。このチューブにスピンカラムを移す。</li><li1分間室温でセンターをRNeasyシリカ膜とインキュベートへ>ピペットで30μlのRNaseフリー水。フルスピードで1分間チューブと遠心分離機を閉じます。</li><li>慎重に戻って同じスピンカラムのをRNeasyシリカメンブレンの中央に1.7ミリリットルチューブ中に回収されてから30μlを移す。同じ1.7ミリリットルのコレクションチューブに再度列を配置し、室温で1分間インキュベートする。フルスピードで1分間遠心。この二重溶出は、cRNAの最大量は、膜から回収されることを保証する。</li><li>適切に新しい1.7ミリリットルの遠心管とラベルするために、このクリーンなビオチン標識cRNAを転送します。</li><li> RNAの単離操作中に上記と同じ手順を使用して、cRNAの濃度を決定します。濃度と280分の260の比率を記録。</li></ol><p class="jove_title"> 8。ターゲットの準備のためのcRNAを断片化する</p><ol><li>あなたの識別情報と0.5ミリリットルのPCRチューブにラベルを付けます。チューブにcRNAの相当する額の5 UGを転送する。 16.0 ULへの総容積をもたらすし、チューブに5倍の断片化バッファー4.0μLを追加するのに十分なRNaseフリー水を追加します。管の総体積は20.0 ULにする必要があります。</li><li>ボルテックス10秒間チューブと遠心分離機。サーモサイクラー中で30分間94℃でチューブをインキュベートします。インキュベーション後、氷上に置く。</li></ol><p class="jove_title"> 9。アガロースゲルを用いて断片化および非分割化cRNAの評価</p><ol><li> 1.2パーセントプレキャストアガロースゲルを使用してE -ゲル電気泳動装置を設定します。製造業者の勧告にしたがって2分間ゲルを事前に実行し</li><li> E -ゲル上の各ウェルに水14μlを添加する。</li><li>よく混合するには、上下の各ウェルにピペットに各サンプルの2μlのを追加。各サンプルの断片化と断片化されていないcRNAを両方を分析する。隣接レーンにサンプルを（断片化と断片化されていない）をロードするのが最善です。各レーンにそれぞれのサンプルのアイデンティティを記録。</li><li>ゲルの1レーンにDNAラダー（私は標準またはNovagen社PCRマーカーのサイズを決定BioLine簡単ラダー）4μlを加え、</li><li> 20分間ゲルを実行します。</li><li>トランスのE -ゲルを可視化する。ゲルの写真を撮影する。</li></ol><p class="jove_title"> 10。酵母2.0のGeneChipへのハイブリダイゼーション</p><p class="jove_step">代表的な結果：</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig1.jpg" alt="Figure 1" ><strong>図1。</strong>スキャンしたアフィメトリクスのGeneChip酵母イメージ（アフィメトリクスGeneChipのオペレーティングソフトウェア（GCOS））</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig2.jpg" alt="Figure 2" ><strong>図2。</strong対照及び処理酵母のデータを比較するすべての遺伝子転写産物（〜6700遺伝子）の> 2次元散布図、。各ポイントは、単一の遺伝子を表します。紫の色の遺伝子は赤色に着色する遺伝子に変化がなければ、示差的に発現される遺伝子を示す。示差的に発現された遺伝子についての説明は、対応する凡例にラベルが付いていますし、ほとんどがこの例では、細胞周期制御に関与している。 （アフィメトリクスGeneChipのオペレーティングソフトウェア（GCOS））</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig3.jpg" alt="Figure 3" ><strong>図3。</strong>このフローチャートは、影響を受ける生物学的経路における示差的に発現された遺伝子を示しています。赤い星で示されている遺伝子は、減数分裂経路でダウンレギュレートした遺伝子を示す。 （注釈、視覚化および統合された発見のためのデータベース（DAVID）</p><p class="jove_content"<img src="/files/ftp_upload/2585/2585fig4.jpg" alt="Figure 4" ><strong>図4。</strong火山のプロットの>代表的な結果。制御と処理したサンプルは、0.05のカットオフのp -値とカットオフ1.5倍の発現の変化と比較した。このプロットは、親切に教育目的のために学生に寄付Geospizaのジーンシフターのソフトウェアを使用して生成されました。</p>
Discussion
<p class="jove_step">アプリケーションと意義。</p><p class="jove_content">バーモント遺伝ネットワークアウトリーチプログラムは、バーモント州の大学で、州全体eightパートナーの学士の称号の大学に学部のアウトリーチを行っています。 VGNアウトリーチコアの目的は、体験学習を用いた最先端の科学技術＆リソースにバーモントの状態で大学生を公開することです。説明したマイクロアレイモジュールは、2003年に開発され、その後アップグレードされました。それはミニコースとして提供または参加機関における既存の研究室のカリキュラムに統合されています。</p><p class="jove_content">このプロジェクトは、研究大学のコアと学部大学との間で、教育と研究のコラボレーションを促進する。州全体マイクロアレイアウトリーチは、カリキュラムを強化し、中核施設、教員と学生のための研究およびネットワーキングの機会を作成しています。</p><p class="jove_content">学部の教員がプログラムを採用するとき、彼らは適切なアフィメトリクスのGeneChipsと利用可能な注釈があるか提供されてユニークな実験を設計することをお勧めします。実験室のマニュアル、リファレンスおよびPowerPointプレゼンテーションを含む、このモジュールのすべての情報はオンラインで入手できます（バーモント遺伝ネットワーク、2008）です。</p><p class="jove_step">重要なステップ：</p><p class="jove_content"<em> Spheroplasting：</em>顕微鏡下で成功したspheroplastingを観察することが重要です。それは回転楕円体で、その結果酵母の腫れを引き起こすとしてSDSの使用は非常に有益です。出芽細胞が同様に回転楕円体を形成することを観察することが重要です。部分的なspheroplastingが観察されている場合は、lyticaseによる拡張治療が推奨されます。</p><p class="jove_content"<em>ペレットのクリーニング：</em>沈殿反応とその後のエタノール洗浄ステップ中に、cDNAのペレットを失うことは非常に簡単です。ペレットへの細心の注意と細心の注意が不可欠です。</p><p class="jove_content"<em>メンブレンの中央に水をかける。</em>膜からのRNAの溶出ステップでは、それは"噴出"を直接シリカメンブレンの中央に水30μlのに重要です。これが達成されていない場合は、カラムを遠心分離することができ、その結果elutantは再びシリカ膜に再適用することができます。これは、必要な回数だけ繰り返すことができます。</p><p class="jove_step">変更と製品の置換：</p><ol><li>代替RNAクリーンアップ列を置換することができます。例としては、USB予備校 – 使いやすさとInvitrogen社ピュアリンクRNAキット、および少数を示すためにオメガRNAクリーンアップキットです。</li><li>分裂酵母は、オプションの酵母です。アフィメトリクスGeneChipは、同一チップ上の両方のゲノムが含まれています</li><li>様々な治療および時刻は、使用することができます。これは、薬物療法、温度の治療、抗酸化剤などの治療時間も調整される可能性が含まれる場合があります。</li><liメソッドは、オリゴ（dT）プライマーの使用を採用説明したので、> DNase処理が必要ない場合もあります。</li><li>これは、同じ30μlのアリコートと列からRNAの二重溶出を行うことが要求されていません。かつてほとんどの場合適切です。これは、完全な回復が得られることを保証することが提案されている。さらに、カラムからRNAを溶出するために使用される水は、° C、さらにシリカカラムからRNAを回収する能力を高めるために65〜予備加熱することができます。</li><li>多くのメソッドは、RNAを定量するために用意されています。エッペンドルフと光度計は、使用の容易さのために選択と正確さをテストされています。</li><li>アガロースゲル電気泳動は、多くの標準的な実験装置を用いて行うこと。 E -ゲルは必須ではありませんが、それはRNaseフリーであるとゲルの凝固待ち時間を必要としないため、望ましいされていません。</li><li製品の>注文情報が提供されています。しかし、多くの一般的な試薬が複数のベンダから購入することができます。</li><liそれはよりコスト効果的である場合> 1サイクルのcDNA試薬は別途購入することができます。</li><li>ある他のターゲットの準備の方法がありますが、我々はこの1つは学生のためのより多くの教育機会を提供して感じる。</li></ol>
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
<p class="jove_content">バーモント大学、バーモント州遺伝ネットワーク。この出版物は、theNational研究資源センター（NCRR）、国立衛生研究所の成分（NIH）のINBREプログラムからブリンプログラムと助成番号P20 RR16462から助成番号P20 RR16462を通じて、バーモント州遺伝学ネットワークによって可能となった。その内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNCRRまたはNIHの公式見解を示すものではありません。</p><p class="jove_content">我々は、このモジュールキャッスルトンステートカレッジ、グリーンマウンテンカレッジ、ジョンソン州立大学、リンドン州立大学、マールボロ大学、ミドルベリー大学、ノーウィッチ大学とセントマイケルズカレッジの精製に彼らのコラボレーションと入力して全ての参加のアウトリーチ機関に感謝いたします。</p>
Materials
| General Laboratory Equipment | Company | Product number |
| Spetrophotometer | ||
| Thermocyler | ||
| Microcentrifuge | ||
| Vortex | ||
| Stir Plates (2) | ||
| P-10s pipettors | ||
| P-20’s pipettors: | ||
| P-200’s pipettors: | ||
| P-1000’s pipettors: | ||
| Camera and transilluminator | ||
| Supplies – recommended | ||
| E-Gel Apparatus | Invitrogen | G6000-08 |
| E-Gels | Invitrogen | G6018-02 |
| Axygen 1.7 ml. Clear | Krackler | 383-MCT175C |
| Axygen 0.5 ml clear tubes | Krackler | 383-MCT060C |
| Axygen 2ml capture tubes | Krackler | 383-MCT200NC |
| boxes of P-10 ART tips: | CLP | BT10XL |
| Boxes of P-100 ART tips: | CLP | BT200 |
| Boxes of P-20 ART Tips: | CLP | BT20 |
| Boxes of P-1000 ART Tips: | CLP | BT1000 |
| Yeast Chips | ||
| General Laboratory Supplies | ||
| 25 ml sterile disposable pipets- | ||
| 5ml sterile disposable pipets- | ||
| Microfuge tube racks | ||
| KimWipes: | ||
| Lab Coats | ||
| Stir Bars | ||
| Culture flasks | ||
| Innoculating loops | ||
| Sharpies | ||
| Gloves | ||
| Autoclave tape | ||
| Stirrer bars | ||
| Reagents | ||
| 30% Hydrogen Peroxide | EMD Millipore | 386790 |
| HBSS without Ca, Mg, or dye | Sigma-Aldrich | H6648-100ml |
| Qiagen Rneasy Mini Kit: | Qiagen | 74104 |
| Qiagen DNase Kit: | Qiagen | 79254 |
| Rnase Remover | Denville Scientific | D1180 |
| Harleco Alcohol 100% | EMD Millipore | 65347 |
| ENZO IVT Kit | ENZO | ENZ-42655-10 |
| Lyticase: one bottle | VWR | IC19012310 |
| Water, Cell Culture grade | EMD Millipore | 4.86505 |
| Yeast culture: | ATCC | 18824 |
| YPD broth powder | EMD Millipore | 4.8504 |
| D(+) Glucose, Anhydrous | EMD Millipore | 346351 |
| Sorbitol | EMD Millipore | 56755 |
| EDTA | EMD Millipore | 4005 |
| SDS solution, 20% | EMD Millipore | 7990-OP |
| Pellet Paint | EMD Millipore | 69049 |
| PCI RNase DNase free (7 aliquots): | Fisher | AC32711-500 |
| 7.5M NH4OAc | Fisher | ICN1987 5980 |
| Fragmentation Buffer (200 mM Tris-Acetate, pH 8.1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA) | ||
| Trizma Base | Fiaher | 50-899-90034 |
| KOAc | Fisher | NC9757725 |
| MgOA | Fisher | NC9681042 |
| Loading Dye | Invitrogen | 10482055 |
| PCR Markers | EMD Millipore | 69278-3 |
| Phase Lock Gels | Fisher | FP2302820 |
| One-Cycle cDNA Kit | Invitrogen | A10752-030 |
| Includes; | ||
| E. coli DNA Pol | ||
| dNTP’s | ||
| T4 DNA Pol. | ||
| T-7 oligod(T) | ||
| 0.5ml EDTA pH 8.0 | ||
| First Strand Buffer | ||
| E. Coli RNaseH | ||
| Second Strand Buffer | ||
| E. Coli DNA ligase | ||
| SuperScript II | ||
| DTT | ||
Referencias
- Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).
- D’Autréaux, B., Toledano, M. B. ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).
- Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis. J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).
- Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).
- Vermont Genetics Network. . Microarray Outreach. , (2008).
- . . Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual. , (2004).
- Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources. Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Dennis, G., Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery. Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).
Citar este artículo
Tighe, S., Hunter, T., Reed, P., Murray, J. Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (50), e2585, doi:10.3791/2585 (2011).