Прижизненные микроскопия пахового лимфатического узла
Summary
Техника для выполнения прижизненной микроскопии паховых лимфатических узлов (ЛУ) описана. Такая методика позволяет в режиме реального времени,<em> В естественных условиях</em> Изучение микроциркуляторного лимфатических узлов и структура как во время гомеостаза и инфекции. Эта техника может быть адаптирована для исследования клетка с торговлей людьми и другими сайтами лимфатических узлов.
Abstract
Лимфатических узлов (Л. Н.), расположенные по всему телу, являются неотъемлемой частью иммунной системы. Они служат в качестве сайта для индукции адаптивного иммунного ответа и, следовательно, развитие эффекторных клеток. Таким образом, LNS играют ключевую роль в борьбе вторжение болезнетворных микроорганизмов и поддержания здоровья. Выбор LN для изучения продиктована доступности и желаемой модели, паховые лимфатические узлы хорошо расположены и легко поддерживает исследования биологически соответствующих моделей кожи и слизистой оболочки половых инфекций.
Паховые Л. Н., как и все LNS, имеет разветвленную сеть капилляров снабжая его кровью. В общем, это микрососудистых сеть включает в себя основные артериол подачи LN, которые впоследствии филиалов и каналы высокой эндотелия венул (ВЗУ). ВЗУ являются специализированными для облегчения торговли иммунных клеток в Л. во время обеих гомеостаза и инфекции. Как ВЗУ регулировать торговлю в LN при обоих этих условий в районе интенсивных исследований. Л. Н. кормить артериол, имеет прямое влияние на входе ВЗУ и является основной запас питательных веществ и клеточных богатых крови в LN. Кроме того, изменения в питании артериол вовлечены в содействие индукции адаптивного иммунного ответа. Л. Н. микроциркуляторного имеет очевидное значение для поддержания оптимального кровоснабжения Л.Н. и регулирования притока иммунной клетки в Л.Н., которые являются ключевыми элементами в нормальной работы Л. Н., а затем иммунный ответ.
Способность к обучению Л. Н. микрососудов в естественных условиях является ключом к выяснению того, как иммунная система и микроциркуляторном взаимодействуют и влияют друг на друга в пределах LN. Здесь мы представляем метод в естественных изображений паховых лимфатических узлов. Мы делаем ставку на визуализацию микроциркуляторном русле Л.Н., обращая особое внимание на методы, которые обеспечивают изучение здоровых сосудов, способность сохранять изображения жизнеспособных судов в течение нескольких часов, и количественная оценка судна величины. Методы перфузии микроциркуляторного русла с вазоактивных препаратов, а также потенциал для выявления и количественной сотового трафика также представлены.
Прижизненные микроскопии паховые Л. Н. обеспечивает прямой оценки микрососудистых функциональность и в режиме реального времени интерфейс прямого интерфейса между иммунными клетками, Л. Н., и микроциркуляцию. Эта технология потенциально может быть в сочетании с много методов иммунологической и флуоресцентные маркировки клеток, а также манипулировать для исследования сосудистой других LNS.
Protocol
Discussion
Прижизненные микроскопии паховых лимфатических узлов, представленные здесь дает возможность изображения микрососудов из лимфатических узлов в естественных условиях. Таким образом, это облегчает средством прямого, в режиме реального времени наблюдения. Визуализация Л. Н. микроциркуляторного это уникальный сайт, который позволяет изучать взаимодействие между иммунной и сосудистой сети. Использование этого препарата, фокус может быть направлен конкретно на иммунный ответ, изменения в сосудистой сети, или при взаимодействии между ними.
Как и во всех экспериментальных подходов, стандартных прижизненной микроскопии имеет свои преимущества и ограничения. Стандартный IVM, такие, как подготовка, описанные здесь, могут быть легко изменены, и было ранее продемонстрировано авторами, чтобы epifluorescent микроскопии с помощью введения флуоресцентных красителей трассирующими или маркированы клеточных популяций. Хотя стандартные IVM не дает возможности трехмерной визуализации и трассировки, такие как бы дается двухфотонной микроскопии или ангиографии, сотовые отслеживания до сих пор достигнуто в двух измерениях позволяет клетки к клетке и клетка-сосудистой взаимодействие будет наблюдается и в количественном выражении и в сочетании с в естественных условиях администрации и последующим окрашиванием флуоресцентными антитела могут быть использованы, чтобы дать данные о белка / маркер выражение в режиме реального времени.
Примечательно, что альтернативные методы визуализации требуют статической среды для изображений; зажим хирургический области или добавление покровное на плоской подготовки часто необходимо. Это ограничивает, если не исключает, способность активно заливать сосудистых или других посредников по подготовке к оценке целостности сосудистой и физиология и т.д., или использовать другие методы, такие как проводится вазодилатации экспериментов в IVM подготовки. Кроме того, стандартные IVM не требует абсолютно плоской подготовки и не зависит от движения, как, например, порожденных дыхание животного. Это позволяет стандартным IVM, которые будут использоваться в более хирургических областях с большей воспроизводимости. Примером этого может служить паховых лимфатических узлов подготовки описаны здесь. Учитывая размер и форма лимфатического узла, препарат не может быть сделан плоским, не повредив ткани и расположения узлов приводит к возникновению существенного движения из-за животных дыхания. Такие вопросы трудно будет преодолеть с помощью других методов, но легко дело с использованием стандартного препарата IVM описано.
Таким образом, подготовка подробного выше, может быть объединена с любым количеством других биохимических, сосудистых и / или иммунологические методы, такие как передача подмножеств активирован или меченых клеток, индукции гипоксии, и чрезмерной экспрессии истощение сосудистой посредников. Тем не менее, дополнительные приложения, которые зависят от здоровья начальной подготовки. Таким образом, жизненно важно, чтобы всегда проверять здоровье сосудистой время отображаемого и оценены. Ключевые моменты для достижения здоровья подготовки является обеспечение подготовки постоянно озарен уравновешенной PSS при температуре тела и минимизация контакта и нагрузки на хирургическое области во время операции.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа финансируется Канадским институтом медицинских исследований, Канадский фонд инноваций, Университета Британской Колумбии Центра исследований крови и Университет Северной до нашей эры.
Materials
| Name of the reagent | Company |
|---|---|
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Nitroprusside | Sigma Aldrich |
| Phenylephrine | Sigma Aldrich |
| Acetylcholine | Sigma Aldrich |
| Magnesium chloride heptahydrate | Sigma Aldrich |
| Sodium Pentobarbitol |
Referencias
- Bearden, S. E., Payne, G. W., Chisty, A., Segal, S. S. Arteriolar network architecture and vasomotor function with ageing in mouse gluteus maximus muscle. J Physiol. 561, 535-545 (2004).
- Looft-Wilson, R. C., Payne, G. W., Segal, S. S. Connexin expression and conducted vasodilation along arteriolar endothelium in mouse skeletal muscle. J Appl Physiol. 97, 1152-1158 (2004).
- Payne, G. W., Madri, J. A., Sessa, W. C., Segal, S. S. Histamine inhibits conducted vasodilation through endothelium-derived NO production in arterioles of mouse skeletal muscle. Faseb J. 18, 280-286 (2004).
- Smeda, J. S., Payne, G. W. Alterations in autoregulatory and myogenic function in the cerebrovasculature of Dahl salt-sensitive rats. Stroke. 34, 1484-1490 (2003).
- de With, M. C., de Vries, A. M., Kroese, A. B., van der Heijden, E. P., Bleys, R. L., Segal, S. S., Kon, M. Vascular anatomy of the hamster retractor muscle with regard to its microvascular transfer. Eur Surg Res. 42, 97-105 (2009).
- Domeier, T. L., Segal, S. S. Electromechanical and pharmacomechanical signalling pathways for conducted vasodilatation along endothelium of hamster feed arteries. J Physiol. 579, 175-186 (2007).
