Uma maneira simples para medir a sensibilidade de etanol no Flies

1. Criando a câmara de exposição Cortar um plug frasco pela metade utilizando uma lâmina de barbear. Alternativamente, use bolas de algodão. Empurrar o meia ficha frasco, ou a bola de algodão, para o fundo de um frasco de comida para fazer uma superfície lisa que as moscas não vai ficar preso dentro Se fazer câmaras de exposição múltipla, certifique-se que o plugue do frasco e alimentos ocupam o mesmo volume em cada câmara. A marca na parede do frasco pode facilitar este processo. 2. Expondo as moscas Colete 8 voa de um sexo, idade 1-5 dias, o dia antes da exposição em frascos de alimentos regulares, sem fermento. Classificá-los em código, de modo que o experimentador é cego para o genótipo real / cepa utilizada. Transferência dos oito voa para as câmaras de exposição tocando. Não anestesiar. Adicionar uma pequena quantidade de alimentos corantes, por exemplo, ácido azul 9, a 200 etanol prova para torná-lo facilmente visível. Brasão fundo do frasco de um plug, ou bola de algodão, com 0,5 ml de etanol. Insira o plugue de etanol para o frasco de exposição. Garantir que o álcool é voltada para o frasco, e não em direção à parede do frasco. Iniciar um temporizador de contagem acima. 3. Intoxicação registro induzida por etanol Cada minuto após o timer é iniciado, toque na câmara de exposição no banco de reservas para surpreender as moscas e observá-los por dez segundos. Registrar o número de moscas estacionárias para cada minuto. Moscas são estacionários se eles não podem sair de costas, permanecem em um local, ou rapidamente vibrar as asas durante toda a dez segundos período de observação. As moscas últimos são considerados estacionários porque a grande maioria destas moscas são estacionários entre os períodos de movimento rápido das asas. Moscas não são estacionários se eles podem sair as costas e ir embora e / ou até a parede do frasco. Um ensaio de exposição termina quando quatro ou mais moscas são registrados como estacionário. Descartar moscas e deixar o ar câmara de exposição para fora para reutilização posterior. 4. Determinar o tempo de sedação 50% O tempo para sedação de 50% (ST50) é o tempo após o início da exposição ao etanol, quando quatro dos oito moscas permanecem estacionários. Isto é determinado da seguinte forma: Ou: no minuto primeira medição, quando exatamente quatro moscas são estacionárias. Ou: se menos de quatro moscas (Y1) são estacionários em um ponto do tempo (X minutos), e mais de quatro (Y2) no próximo ponto de medição do tempo (minutos X +1), então linearmente interpolar o ST50 utilizando a fórmula: ST50 = (4 – Y1) / (Y2 – Y1) + X 5. Repita a exposição para determinar a tolerância Expondo as moscas Determinar o ST50 (wt) para uma estirpe de controlo do tipo selvagem utilizado na experiência. Expor os grupos experimentais de moscas para o etanol, como descrito acima. Medir a sua ST50 (1), mas continuam a expor até chegar o tempo 2x ST50 (wt). Transferência das moscas de volta em um frasco vazio de alimentos, e segure por 4 horas. Re-expor as moscas, e determinar o ST50 (2) da exposição 2. Determinar a tolerância Calcule a tolerância em% como (ST50 (2) / ST50 (1) – 1) x100. 6. Resultados representativos: Mostrados aqui, são alguns resultados representativos obtivemos com 6-8 frascos de moscas por genótipo e dose. Se o seu erro padrão é substancialmente maior, então um problema sistemático provavelmente ocorreu. Certifique-se de que o etanol enfrenta nas câmaras de exposição, e que as câmaras são o mesmo volume. Figura 1. Curva de resposta de dose do tipo selvagem voa expostos a aumento do percentual de etanol. Oito frascos de moscas foram expostos por dose e sexo. Machos e das fêmeas mostram o ST50 mesmo em cada dose (p> 0,22, 2-way ANOVA), enquanto o ST50 em doses diminui significativamente com a dose crescente de etanol (p <0,001). Note que voa de superlotado garrafas pode ser substancialmente menor do que os de garrafas saudável, e esta diferença de tamanho pode afetar o ST50. Garrafa de semente, cada uma com fêmeas 15-20 postura por 1-2 dias para obter a densidade larval ótimo por garrafa. Figura 2. Expondo voa para tanto o etanol 90%, ou 100% reproduz o anteriormente descrito etanol resistência causada pelo branco rabbit1 mutation2 (p <0,001, 2-way ANOVA). Figura 3. Repita a exposição ao etanol a 100%, espaçadas por um intervalo de recuperação de 4 horas, causa um aumento significativo na ST50 após a segunda exposição (p <0,001, t emparelhado-Teste). Note que as moscas foram expostos por 24 minutos durante a primeira exposição (correspondente a duas vezes ve nd suas ST50). Exposição para um curto período de tempo (12 minutos) não causou um aumento significativo na ST50 sobre a re-exposição (dados não mostrados).