전체 마운트를 사용하여 현장에서 하이브 리다이 제이션

1. cDNA 플라스미드 대상의 변환 부품 I : 플라스미드의 변환 (소요 시간 : 3 시간 플러스 하룻밤 배양) 42 ° C의 물을 욕조에 따뜻한 SOC 영양소 국물 (반응 당 500 μL) 얼음 유능한 세포를 해동 25 μL 관할 세포에 플라스미드 1 μL 추가 20 분 동안 얼음 플레이스 45 초 동안 42 ° C의 물을 욕조에 열 충격 세포 바로 이분을 위해 얼음에 세포를 장소 세포의 각 유리병 42 ° C 영양 국물 500 μL 추가 ° C 분당 255 회전에서 2 시간 동안 (RPM) 37시 쉐이크 Luria Bertani (LB) 한천 플레이트 접시에 75 μL 변환 믹스 부화 플레이트 37 ° C에서 거꾸로 하룻밤 부 II : E. 콜리 문화 (소요 시간 : 15 분 플러스 하룻밤 배양) 문화 튜브에 각각 반응 나누어지는 3 ML의 LB의 국물과 50 MG / ML 암피실린 3 μL를위한 한천 플레이트에서 1 박테리아 콜로니을 다쳤고, 각 문화 튜브에 추가 37 문화 튜브를 흔들어 ° C를 255 RPM 하룻밤에 파트 III : 플라스미드 준비 (소요 시간 : 1.5 시간) 5 프라임 FastPlasmid 미니 키트 (카탈로그 # 2300000)를 사용하여 야간 문화 플라스미드 분리 준비 플라스미드의 존재를 확인하려면, ethidium의 브로마이드 물들일 1 % 트리스 – 아세테이트 – EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (태) 겔의 키트에서 eluted DNA를 실행 2. 원위치 발굴 – 표시 RNA 프로브 합성에서 부품 I : 플라스미드의 선형화 (소요 시간 : 2.5 시간) 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : 플라스미드 준비 20 ML 제한 효소 * 2 ML 버퍼 ** 10 ML 소 혈청 알부민 10X (BSA) 10 ML 디에틸 Pyrocarbonate (DEPC) 물 58 ML 100 ML 37 ° C 2 시간 동안 부화 * 플라스미드에 따라 다릅니다 ** 제한 효소에 따라 다릅니다 부 II : 전사 (소요 시간 : 3 시간) 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : 플라스미드 선형 4 ML 10X 전송 버퍼 ** 4 ML Digoxigenin 라벨 믹스 4 ML 효소의 * 2 ML RNase 억제제 2 ML DEPC 워터 24 ML 40 ML 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다 효소의 * 2 μL 추가 1 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다 DNase 2 μL 추가 37 품어 ° C를 20 분 * 플라스미드에 따라 다릅니다 ** 효소와 다름 파트 III : 강수 (소요 시간 : 하룻밤 사이에 부화 1 시간 5 분 플러스 2 시간 원심 분리기하고 다시 정지) 0.2M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 4 μL 추가 4M 염화 리튬의 5 μL 추가 얼음 차가운 100 % 에탄올 150 μL 추가 하룻밤에 -80 ° C에서 2 시간 동안 부화 4 ° C, 가만히 따르다 거리에 뜨는 30 분 14,000 rpm으로 원심 분리기 7분에 대한 건조 펠릿 20 μL의 DEPC 물에 다시 중지 37 품어 ° C를 5 분 파트 IV : 분별화은 – 프로브 크기가 0.6 킬로바이트보다 큰 경우에만 수행 (소요 시간 : 대개, 프로브의 크기에 따라 20여 분 다름 없음) 1.5 ML의 microfuge 관에서 결합 : RNA 프로브 20 ML DEPC 워터 12 ML 중탄산 4 ML 나트륨 탄산염 4 ML 40 ML 60 ° C의 물을 욕조에 품어. 방정식에서 배양 시간을베이스 : 시간 (min.) = (KB 시작 – 킬로바이트을 원하는가) / (KB X를 시작 0.11 x는 킬로바이트를 원하는) 평균 원하는 크기 = 0.6 킬로바이트 파트 V : 최종 강수량 (소요 시간 : 5 분하룻밤 부화, 1 시간 백인 군대가 플러스 2 시간)을 원심 분리기 및 겔 전기 영동을 다시 중단 1 시간 40 μL DEPC 물을 추가 8 μL 아세트산 나트륨을 추가 1.04 μL 빙초산 추가 240 μL 얼음 차가운 100 % 에탄올 추가 하룻밤에 -80 ° C에서 2 시간 동안 부화 4 ° C, 가만히 따르다 거리에 뜨는 30 분 14,000 rpm으로 원심 분리기 7분에 대한 건조 펠릿 20 μL의 DEPC 물에 다시 중지 섞어 소용돌이 riboprobe의 존재를 확인하려면, ethidium의 브로마이드와 1 %의 태 젤 자국에 다시 정지 솔루션을 실행 3. 원위치 하이브리드화에서 전체 마운트 부품 I : 태아의 고정 및 Proteinase K의 소화 (소요 시간 : 수정 하룻밤 플러스 4시간 저장 다음날, 2.5 시간 창고에서 파트 II까지) zebrafish 배아를 개최 수집하고 4 박 4 % paraformaldehyde (PFA)에서 해결 ° C 인산염에서 수정 배아를 씻어은 10 분마다 트윈 – 20 (PBSt) 3 회 0.1 %를 포함하는 호수 버퍼 세부적으로 밀고 집게를 사용하여 실험 시약 수동 dechorionate 배아 (필요한 경우)에 태아의 노출을 보장하기 위해 한 시간 만이라도 각 세척을 25 % 등급 일련의 세탁과 PBSt의 50 % 메탄올에 의해 배아를 탈수 후 -20 ° C에서 100 % 메탄올에 저장 때 사용할 준비가 50 % (2 회) 25 % (1 회) 10 분마다 PBSt의 메탄올로 세척하여 PBSt에서 배아를 rehydrate. 마지막으로 100 % PBSt 10 분만에 각 2 번 씻는다. 정확한 타이밍 PBSt / 메탄올 세척을위한 중요하지 않다 어두운 안료를 제거하는 PBSt에 10 % 과산화수소 용액, 필요한 경우에 블리치 배아. 배아는 배아의 연령에 따라 약 10-20 분 과산화수소 용액에 부화해야하며, microfuge 튜브의 뚜껑이 공기 압력의 빌드 – 업 방지하기 위해 열린 남아 50 MG / ML Proteinase K와 다이제스트 배아가 배아의 연령에 따라, 3-15 분 동안 PBSt에서 1:5000 희석 다음 다시 수정의 30 분 4퍼센트 PFA의 배아, 그리고 5 분 각각에 대해 PBSt 3 번 씻어 부 II : Riboprobes의 하이브리드화 (소요 시간 : 3 시간 플러스 하이브 리다이 제이션을위한 야간, 1.5 시간 파트 III에 다음날) 2~3시간에 대한 preheated 70 ° C 물 목욕에 prehybridization 솔루션 (PHS)와 배아를 Prehybridize , PHS를 제거 70 ° C 하룻밤에 품어 0.5 ML의 하이브 리다이 제이션 솔루션과 1.5 μL 이전 합성 Digoxigenin 표시된 riboprobes를 추가합니다. 온도 riboprobe 대상에 따라 몇도 이내에 수시로 바뀔 수 있습니다 그 다음날, 70 배아를 씻어 ° C 십분 각 2X 살린 – 나트륨 구연 산염 (SSC)의 PHS 75 % 50 %, 25 %의 등급 솔루션 후 68시 30 분 0.2X SSC의 세척 ° C 상온 10 분 각 Maleic 산성 버퍼 (MAB) 2 회 세척 파트 III : 안티 Digoxigenin (α – 발굴) 항체 인큐베이션 (소요 시간 : 3 시간 더하기 차단하는 숙박, 2.5 시간 파트 IV에 다음날) 12 잘 접시에 배아를 전송 상온에서 최소 3 시간 동안 1-2 ML 차단 솔루션에 사전 차단 배아 동시에,이 솔루션에서 차단 솔루션의 두 번째 볼륨을 준비하고 안티 – digoxigenin 항체를 1:2000 diluting하여 항체를 사전 차단 사전 블록을 제거하고 1-2 ML 사전 차단 α – 발굴 솔루션을 추가, 4 밤새 품어 ° C 그 다음날, MAB에서 배아를 씻으십시오. 배아 처음 5 분 MAB에 부화 허용, 다음 버퍼 변경을 수행하는 두 십분 한 삼십분 한 60분 간격에 대한 부화. 정확한 타이밍이 필요하지 않습니다 오분 알카라인 인산 가수 분해 효소 (AP) 버퍼에 각 태아에게 3 회 와시 파트 IV : 스테 이닝 및 최종 처리 (소요 시간 : 얼룩을 위해 하루 1 시간 사용 riboprobe에 따라 글리세롤의 세척, 글리세롤 세척 당 6-10시간의 시작 4 시간은 글리세롤에 저장되어있을 수 있습니다) 얼룩이 충분 때까지 배아에 1-2 ML의 얼룩 솔루션을 추가 호일로 접시를 포장하고, 정기적으로 (매 20 분)에 염색법 확인 얼룩 반응을 중지 5 분마다 PBSt 2 회와 배아 와시 배경 얼룩을 제거하는, 100 % 메탄올에 다음 25%에서 십분 세척 (1 시간) 50 % (2 회) PBSt에서 메탄올을 사용하여 배아를 탈수 배아는 상온에서 최소 2 시간 동안 100 %의 메탄올에 부화 허용 50 % 십분 세척 (2 회) 25 % (1 회) PBSt에서 메탄올을 사용하여 PBSt에 Rehydrate 다음 백퍼센트에 PBSt 2 번 씻어 스테인드 E를 전송4 등급 세척 일련의, 그리고 저장을 사용하여 PBSt에 80 % 글리세롤 솔루션 mbryos, ° C. 요리법 : LB 한천 플레이트 – 10g의 LB 한천 + 250 ML 증류수, 압력솥이 때 시원한 각 배양 접시에 15-20 ML 따뜻한 솔루션을 부어, 250 μL 암피실린를 추가, 한천이 응고 수 LB의 국물 – 12.5 g의 LB 스프 + 200 ML 증류수, 압력솥은 사용하기 전에 냉각 허용 1% 태 젤 – 0.4 g 아가로 오스, 40 ML 1X 태, 2 μL ethidium의 브로마이드, 부하 7 μL 플라스미드 (cDNA 대상의 플라스미드 변환) 또는 3 μL riboprobe 4 μL DEPC 물 (현장 발굴 – 표시 RNA 프로브 합성에서) + 1 μL 로딩 염료, 5 μL DNA 사다리 Prehybridization 솔루션 50 % 포름 아미드, 배 SSC, 9.2mM 구연산, 1 % 트윈 – 20 하이브 리다이 제이션 솔루션 prehybridization 솔루션 플러스 500 μg / ML tRNA 50 μg / ML의 헤파린 MAB – 100mM Maleic 산성, 150mM NaCl, 0.2M NaOH, 0.1 % 트윈 – 20, 7.5 산도 MAB에 차단 솔루션 – 3 부품 MAB, 1 일부 10% Boehringer 차단 시약 1 일부 열 양고기 혈청을 비활성화 9.5에 AP 버퍼 60mM 트리스 – HCL의 산도, 60mM NaCl, 30mM MgCl 2, 0.1 % 트윈 – 20 얼룩 솔루션 – 5 – 브로모 -4 – 클로로 – 3 – 인돌릴 인산염 (BCIP) 및 니트로 파란색 tetrazolium (NBT) AP 버퍼 4. 대표 결과 제대로 수행되면, NBT, BCIP, 그리고 알칼리성 인산 가수 분해 효소의 반응은 자주색 얼룩으로 zebrafish 배아에 나타납니다 보라색 침전물을 형성합니다. Riboprobes는 이전에 다음 ID로 관심의 유전자에 해당하는 cDNA의 합성해야합니다. 따라서, 그것은 어떤 얼룩 시각 관심의 유전자가 특정 발달 단계에서 베꼈는데되어있는 zebrafish의 영역을 나타냅니다 체결하실 수 있습니다. fgf8a (Reifers 외, 1998,,. 그림 2) deltaC (오츠 외, 2005).이 과정의 목적을 위해 riboprobes는 aldh1a2 (; Begemann 외, 2001;. 그림 1 이전 raldh2)에서 합성되었다; myod1 (와인버그 외, 1996.) shha (. 크라우스 외, 1993), pax2a (브랜드 외, 1996;. 그림 3)과 myl7 (이전 cmlc2;. Yelon 외, 1999) cDNA. 얼룩은 정중선과 somites, tailbud, myotome, 뇌, 심장을 포함한 해부 학적 구조를 예상했다. Ace/fgf8a의 돌연변이가 이러한 구조의 많은 결함을 가지고 것으로 예상했다. 얼룩이 쉽게 표준 해부 현미경을 사용하여 시각되었습니다. (Schoenwolf 2009.; D' 코스타 외, 2009;, Schmoldt 외, 2009. 클락, 2003) 추가 소스는 여기에 설명된 것과 유사한 기법을 기원에 대한 자세한 내용 및 문제 해결을 포함합니다. aldh1a2 특정 riboprobes와 hybridized되어 그림 1. zebrafish 배아 24 시간 게시물 수정. 구체적인 얼룩은 눈, hindbrain, 가슴 지느러미 봉오리 primordia 및 somites에서 볼 수 있습니다. 앞쪽에이 최고입니다, 후부는 바닥입니다. 그림 2. fgf8a위한 프로브 특정 함께 hybridized되었습니다 발전 13 체절 단계에서 zebrafish 배아. 구체적인 얼룩은 telencephalon, 지느러미 diencephalon, midbrain – hindbrain 경계, somites 및 tailbud에서 본 것입니다. 복부의 왼쪽이며, 지느러미는 올바른 것입니다. 그림 3. pax2a, 신경 시스템을 시각화하는 데 유용 강력한 마커에 대한 riboprobe의 특정과 hybridized되었습니다 22 시간 게시물 수정의 zebrafish 배아. 구체적인 얼룩은 맥락막의 균열 (fissure), midbrain – hindbrain 경계, 귀의 소포 및 척수에있는 뉴런에서 볼 수 있습니다. 왼쪽 앞쪽에와 도설 볼 수 있습니다.