Verbeterde visualisatie en kwantitatieve analyse van de Drug effecten met behulp van micropatterned cellen

1. Cel Voorbereiding en zaaien op Micropatterns Plaats twee CYTOOchips in 2 onafhankelijke bronnen van een 6 wells plaat ervoor te zorgen dat je "CYTOO" in de rechter hoek van het CYTOOchip te lezen. Micropatterns kan fluorescent gelabeld worden met Cy3 of Cy5 kleurstoffen. CYTOOChips gebruikt voor dit experiment hebben Cy3 fluorescent gelabelde micropatterns. LET OP: Houd chips in het donker. Verzamel HeLa cellen (~ 80% confluent) door behandeling met trypsine. Kijk onder een microscoop die cellen goed zijn verspreid door de trypsine behandeling. Verzamelen en centrifugeer cellen op 300g voor 4 min, dan voorzichtig resuspendeer de cel pellet. Tellen cellen en verdunnen tot een concentratie van 15.000 cellen / ml in voltooide DMEM/F12 cultuur media. Verdeel 4 mL (60.000 cellen) in elk putje met een CYTOOchip. LET OP: De plaat moet worden verplaatst zo weinig mogelijk om te voorkomen dat het induceren van een roterende bewegingen in het medium, omdat dit zal de neiging hebben om cellen te concentreren in het centrum. Laat de cellen sediment gedurende 10 minuten onder de motorkap ze vervolgens te verplaatsen naar de cel incubator. Na 10-20 min, zal cellen beginnen zich te houden aan de micropatterns. Na 10 min, regelmatig onder de microscoop. Zodra cellen hebben aangesloten, veranderen de cel medium en zacht spoel de dekglaasje oppervlak met behulp van de volgende procedure: Het houden van de plaat vlak, Zuig voorzichtig het medium met een pipet uit de zijkant van de put. LET OP: Laat nooit de chip uitdrogen, betekent dit nooit meer af te zuigen al het vocht maar laat genoeg om de CYTOOchip te allen tijde te dekken. Voeg 4 ml PBS en zuig eerst weer vanaf het midden van de chip dan verder te gaan naar de zijkant van de put. Aspireren uit de PBS zoals beschreven zonder het blootstellen van de chip aan de lucht. Herhaal dit 3-4 keer. Controleer onder de microscoop voor drijvende cellen: Als een groot aantal drijvende cellen blijven, herhaal dan het wassen. Als je ziet heel weinig cellen, aspiratie een deel van de PBS en vervang deze door 2 ml vers medium. Aspireren en twee keer toe te voegen 4 ml vers medium. Plaats de plaat in een weefselkweek incubator bij 37 ° C met 5% CO 2 voor een minimum van drie uur om het volledige cellen verspreiden bereiken. LET OP: Met deze methode tussen de 10-30% (2000 tot 6,500) micropatterns zal worden bezet door een enkele of meerdere cellen. LET OP: De tijd die nodig is voor de cellen om zich te houden voor het wassen stap en de tijd die nodig is voor de volledige verspreiding van cellen op micropatterns zal specifiek zijn voor elke cellijn. 2. Blebbistatin Behandeling Los de blebbistatin in 100% DMSO een voorraad oplossing van 17 mM te verkrijgen. Verdun de voorraadoplossing verder naar 5 mm met 100% DMSO. Een definitieve verdunning in een kweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 5 uM blebbistatin te verkrijgen in 0,1% DMSO. Voor de besturing omstandigheden voor te bereiden 4 ml medium met 0,1% DMSO alleen. Aspireren van de media op cellen en vervang het met de 4 mL medium voorbereid voor behandelde en controle omstandigheden. Incubeer cellen voor 1 uur bij 37 ° C. 3. Cel fixatie en kleuring van actine Bereiding van oplossingen voor cel fixatie Zie reagens sectie voor de bereiding van cytoskelet buffer (CB) en PFA 5%. CB is bijzonder aanbevolen voor fluorescentie etikettering van actine filamenten en microtubuli. Bereid 1xCB-sucrose: voeg 1 g sucrose aan 2 ml van de CB. Opname van sucrose helpt bij het beschermen interne celstructuren. Bereid 4% PFA-CB-saccharose: Voeg 1 mL 1xCB-sucrose tot 4 ml warm PFA 5%. LET OP: Deze oplossing kan worden bewaard bij 4 ° C voor een paar dagen alleen. PFA fixatie Gebruik een tang op te halen de CYTOOchip op de CYTOO logo en plaats hem (zonder wassen) in een goed van een 6-wells plaat met 2 ml van 4% PFA-CB-sucrose-oplossing Incubeer 10 min bij RT Verwijder de PFA-CB-sucrose en was een keer met PBS Doe een seconde wassen met 2 ml 100 mM NH 4 Cl gedurende 10 min in om resterende PFA verknoping activiteit lessen LET OP: PFA vast dia's kunnen worden opgeslagen in PBS gedurende enkele dagen bij 4 ° C voor organel kleuring voor fluorescerende beeldvorming. Permeabilisatie van de celmembraan met Triton X-100 Permeabilisatie van cellen met wasmiddel mogelijk maakt antilichamen of andere sondes te dringen in de celmembraan en elimineert een aantal van de cytosolische pool van cytoskelet eiwitten die anders kan het contrast van het cytoskelet polymeren waardoor het moeilijk is om hun lokalisatie analyseren. Verwijder NH 4 Cl en voeg 2 ml / putje van 0,1% Triton X-100-CB voor 3 min bij RT Was tweemaal met 2 ml PBS Actin vlekken TL-phalloidin die bindt aan actine inheemse alleen wordt gebruikt om actine FilaMen vlekts. Voeg 2 mL van FITC-geconjugeerd phalloidin verdund 1:2000 in PBS met 1,5% BSA Incubeer 1 uur bij RT Was eenmaal met 2 ml PBS Kernen vlekken Voeg 2 mL van Hoechst (vlek met 1μg / ml in PBS) Incubeer 3 min bij RT Was twee keer met 2 ml PBS Montage van de schuif Pak de CYTOOchips op de CYTOO logo en monteren CYTOOchip op een standaard microscoop dia 25-30 ul van Mowiol of een andere montage oplossing. 4. Microscoop Setup en geautomatiseerde Image Acquisition Tal van imaging-software pakketten bestaan ​​die de controle van de microscoop voor een snelle geautomatiseerde beeldacquisitie en weer te geven. In dit voorbeeld wordt Metamorph imaging-software en automatische acquisities worden uitgevoerd op een Nikon Eclipse Ti microscoop uitgerust met een CCD Hamamatsu-camera en een Intensilight kwik-fiber verlichting. Beelden worden verkregen tegen een vergroting van 20x in drie golflengtes die overeenkomen met DAPI (kernen), Cy-3 (micropatterns) en FITC-Phalloidin (actine). Het aantal micropatterns gevisualiseerd per gebied zal variëren afhankelijk van de camera en objectief setups. CYTOO micropatterns zijn geplaatst op vaste intervallen van elkaar (100 of 130 micrometer) over de chip zeer faciliteren overname. Selecteer vergroting van 20x Open Multidimensional Acquisition (in de menubalk: Apps / Multidimensional Acquisition) en het opzetten van de verschillende parameters van het experiment: Aantal golflengten: 3 Golflengte types: DAPI, FITC, Cy3 Stel belichtingstijd voor elke golflengte door eerst richten op een veld van cellen Autofocus kan worden uitgevoerd op elke golflengte Selecteren waar u gegevens op te slaan Selecteer Cy3 golflengte en de positie van de camera, zodat 12 micropatterns worden gevisualiseerd en in het midden van de camera gebied (4 kolommen en 3 rijen van patronen). Maak een tijdschrift draait Multidimensionele Acquisition. De procedure voor het maken van een tijdschrift is beschreven in figuur 1. Open Scan stadium functie (in de menubalk: Apparaten / Stage / Stage Scan). Het verwerven van 24 beelden die elk 12 micropatterns bij 20x vergroting, voer zes kolommen en vier rijen met -400 um X stapgrootte en 300 micrometer Y stapgrootte. In Set Journal uit te voeren, te uploaden het tijdschrift MDA.JNL. Druk vervolgens op Scannen naar de geautomatiseerde verwerving van het hele blok in de drie golflengten te starten. OPMERKING: De X-en Y-stap maten hier aangegeven is afhankelijk van het aantal micropatterns aanwezig is in een camera veld. Afhankelijk van uw podium op, richting X en / of Y kan verlangen negatieve waarden voor beweging in de juiste richting. 5. Geautomatiseerde Image Processing and Analysis Veel beeldverwerking en analyse software pakketten bestaan. De procedures die hieronder worden beschreven overzicht beeldverwerking en analyse stappen uitgevoerd door twee op maat gemaakte macro's geschreven voor het open source programma ImageJ. De eerste macro CellRef creëert een Reference Cell, de tweede schuine zijde maatregelen stijfheid / ineenstorting van de celmembraan. Beide zijn beschikbaar op aanvraag bij www.cytoo.com . Maak image stacks voor alle drie de kanalen gericht op micropatterns (macro CellRef). Het gebruik van micropatterns vermijdt cel clustering en klonteren, sterk vereenvoudigen van de eerste stap in geautomatiseerde beeldverwerking, die is lokalisatie en segmentatie van de individuele cellen. De fluorescent gelabelde micropattern beelden worden gebruikt voor het definiëren en af ​​te bakenen's die zijn gericht op het micropatterns. Deze regio's worden dan omgezet naar de beelden die in de andere kanalen en bijgesneden. Overeenkomstige bijgesneden beelden worden vervolgens geassembleerd in stapels voor elke golflengte. Een RGB-stack is ook ontstaan ​​uit de fusie van de drie kanalen (figuur 2). Van toepassing zijn enkele cel selectie filter (macro CellRef) Zoals hierboven aangegeven, zijn 10-30% (2000-6,500) van de micropatterns bezet door een enkele cel of meerdere cellen, terwijl de overige micropatterns zijn leeg. Te selecteren beelden die micropatterns bezet door slechts een enkele cel show, de macro detecteert het aantal kernen per beeld en elimineert uit alle stapels (RGB en verschillende golflengten) die met meer dan een kern of geen kernen (figuur 3). Elimineer niet-genormaliseerde en cellen die niet volledig worden uitgestrekt over de micropattern met behulp van cel-gebied cut-off filter (macro CellRef) Voor het verwijderen van delende cellen die zou zijn ontsnapt aan de kernen filter, een ander filter het gebruik van de FITC kanaal voor actine wordt toegepast. Cel wordt berekend en die onder een bepaalde cut off (cel gebieden ongeveer twee keer minder dan de interfase cellen gebied) worden verwijderd uit alle stapels. De cel envelop gebied wordt bepaald door de grootte van het patroon. Lijn cel beelden (macro CellRef) Uit de vorige stappen, afbeeldingen met een micropatterned cellen werden geselecteerd. Hoewel deze beelden zijn gericht op micropatterns, ze zijn nooit allemaal perfect op elkaar afgestemd. Ter afsluiting van het Beeldbewerking, een ImageJ plugin (MultiStackReg) wordt toegepast op alle verzamelde foto's en alle kanalen op basis van de micropattern positie uitlijnen. Deze stap genereert uitgelijnd stapels van de afzonderlijke beelden die nu gebruikt kunnen worden voor single cell analyse of het creëren van een Reference Cell (figuur 4) Het bouwen van een Reference Cell (macro CellRef) Groeiende cellen op micropatterns betekent dat alle cellen dezelfde vormen hebben. Deze normalisatie maakt een nauwkeurige afstemming en overlay van veel mobiele beelden. Samenvattend het signaal in elk beeld over het hele stack kunt een te visualiseren en te meten een "gemiddelde drug effect". De uiteindelijke totale beeld of Reference Cell is een uniek en nuttig instrument voor representatie-en beeldanalyse en kan alleen worden verkregen met micropatterned cellen (figuur 4). In ImageJ, de Reference Cell is opgebouwd door het maken van een projectie van de gefilterde en uitgelijnd beelden van een stack (Afbeelding> Stacks> Z-project). Verschillende projectie methodes kunnen worden toegepast, zoals de gemiddelde of maximale intensiteit, maar meestal een mediaan projectie is gekozen die elimineert de belangrijkste uitschieters van het beeld stack. Ter bevordering van onderzoek van de resultaten, is een LUT (Look Up Tables) het omzetten van de Monocolor afbeelding in een kleur-gecodeerde frequentie map toegepast. Meten en kwantificeren van parameters die van belang (macro hypotenusa) In deze video artikel zijn L-micropatterns gebruikt, omdat de vorm organiseert het actine cytoskelet in een grote stress-vezel. Door te wijzen actine op deze manier, kan blebbistatin impact op het cytoskelet bepaald worden op vele manieren: meten van veranderingen in de kromming van het actine stress-vezel, kleuringsintensiteit, lengte of de dikte van de stress vezel, veranderingen in de morfometrische kenmerken van de actine filamenten of celvorm enz. Deze parameters kunnen worden gemeten, hetzij op individuele cel beelden of op de laatste Reference cel zelf. Hier was de impact van de 5 uM blebbistatin gekenmerkt door het tellen van het aantal ingestorte cellen met behulp van een seconde ImageJ macro met de naam schuine zijde (figuur 7). Kortom, zijn thresholded beelden van de L-micropattern gebruikt om een ​​theoretische schuine zijde van de cel driehoek vorm te geven. Vervolgens wordt drempeling van het actine-lood afbeeldingen uitgevoerd om te benaderen werkelijke celvorm. Het gebied tussen de theoretische schuine zijde van de cel driehoek en de werkelijke concave celmembraan wordt dan gemeten. Wanneer de cel is ingestort, een gebied onder de theoretische hypotenusa verschijnt. Het percentage van de ingestorte cellen wordt gebruikt om de controle te vergelijken en behandeld omstandigheden. 6. Representatieve resultaten Voorbeelden van wat cellen moet onmiddellijk zien op micropatterns en enkele uren na de kritische wasstappen beschreven in 1.6-1.8, zijn weergegeven in figuur 5. Na 15 min op CYTOOchips, zijn rond Hela-cellen waargenomen op gelijke afstanden waaruit blijkt dat zij gehandeld op grond van de fibronectine micropatterns (figuur 5a). Hechting is voltooid wanneer de cellen blijven geïmmobiliseerd ondanks zachtjes schudden van de cultuur schip. Om het aantal micropatterns bezet door meerdere cellen, zijn chips vervolgens gespoeld met PBS tot cellen zweven boven de cytophobic gebieden te verwijderen. Na een aantal uren, zal cellen die volledig zijn uitgerekt over de micropatterns lijken op die in figuur 5b. Typische single cell beelden verkregen na incubatie van cellen met blebbistatin, fixatie en kleuring van actine en kernen zijn weergegeven in Figuur 6. Na de automatische overname van meerdere beelden en beeldverwerking met behulp van de ImageJ CellRef macro, is een kleur-gecodeerde frequentie map gegenereerd die geeft de intensiteit van de actine gemiddeld over alle mobiele beelden (Figuur 6c en 6f). De vergelijking van de Reference Cel voor niet behandelde en behandeld omstandigheden toont het potentieel van deze benadering voor een eenvoudige observatie van het fenotype bestudeerd en is met name handig voor het verkennen van cellulaire effecten van geneesmiddelen. Een voorbeeld van een mogelijke analyse van het effect van blebbistatin op cellen is weergegeven in figuur 7. Het aantal van ingestorte cellen (dwz cellen met een leeg gebied uit hoofde van de theoretische hypotenusa) waargenomen in 50 controle-cellen en 50 cellen behandeld met 5 uM blebbistatin zoals gedetecteerd door de schuine zijde ImageJ macro wordt weergegeven. Het toegenomen aantal ingestort cellen in de blebbistatin behandelde populatie weerspiegelt ontspanning van de stress-vezels en dus spanning op het membraan te wijten aan blebbistatin remming van actinomyosin contractiele krachten binnen de cel. Figuur 1. Procedure voor een nieuw tijdschrift maken met Metamorph. Figuur2. Stroomdiagram van de automatische beeldverwerking procedure. Figuur 3. Filteren uit enkele cellen. Figuur 4. Opbouwen van een Reference Cell. Figuur 5. Cell zaaien. A) Hela cellen gehandeld op grond van micropatterns na het spoelen stap (4x vergroting) B) HeLa-cellen na de volledige verspreiding op L micropatterns (10x vergroting). Figuur 6. Vergelijking van nonpatterned en micropatterned cellen in de controle en drugs behandeld omstandigheden. HeLa cellen werden gezaaid voor 3 uur en behandeld met 5 uM blebbistatin gedurende 1 uur (onderste paneel) of onbehandeld (bovenste paneel). In controle nonpatterned cellen (een), actine assembleert in meerdere vezels, die ongemerkt uit elkaar te halen bij de behandeling met 5 uM blebbistatin (d). Op L-micropatterns, controle cellen een driehoekige vorm (b) te nemen en het ontwikkelen van een grote actine vezel (stress fiber) tussen de twee toppen van de L. In vergelijking met nonpatterned cellen (d), blebbistatin induceert een grote fenotypische verandering op L-micropatterned cellen (e). Directe visualisatie van de effecten van geneesmiddelen en de vergelijking van controle en behandelde voorwaarden kunnen snel worden gevisualiseerd met de Reference Cell presentatie opgebouwd uit 20 cellen. Net als bij individuele cellen, een duidelijke en intense spanning vezels aanwezig is op de controle-Reference Cell (c), terwijl blebbistatin behandelde cellen instorten en de grote stress-vezel verdwijnt (f). Figuur 7. Voorbeeld van een analyse van de effecten van de blebbistatin op cellen met behulp van de macro hypotenusa. Terwijl 25% van de controle cellen waren ingestort, deze steeg met 3 voudig tot 75% in de 5 uM blebbistatin behandelde cellen als gevolg van de verzwakte actinomyosin contractiele netwerk (n = 50 cellen).