Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

1. Giriş Bu video, Drosophila kullanarak ölçüm hareketlilik ve nörodejeneratif hastalıkların tehlikeye öğrenme ve hafıza fonksiyonları göstermek için iki davranış testleri gösterecektir. Öncelikle, lokomotor davranışları olumsuz geotaxis tahlil kullanarak nasıl ölçülebilir gösterecektir. İkincisi, biz olumlu-phototactic sinekleri caydırıcı bir acı tadı ile ışık ilişkilendirmek için eğitilmiş ve daha sonra bellek fonksiyonları değerlendirmek için 6 saat sonra test kullanarak öğrenme ve hafıza yetenekleri değerlendirir. Son olarak, bu davranış testlerinin sonuçları ve sınırlamalar ele alınacaktır. 2. Ekipman ve Reaktifler Çalışmak Fly Stereo kapsamı (Zeiss) Sinekler itmek için küçük boya fırçaları Drosophila karbondioksit (CO 2) anestezi cihazları (Geneseesci, Inc.) Negatif Geotaxis Testi 28.5 x 95 mm Polistren Flakon (Capitol şişe, Inc.) Mini Alarm Timer / Kronometre (VWR Uluslararası) Sharpie kalem Yapıştırıcı Bant Caydırıcı Phototaxis Bastırılması Testi Kinin hidroklorür (Sigma Aldrich; CAS numarası: 6119-47-7) Distile Su Ağırlık olarak hassas seyreltme için dijital ölçme skalası Hızlı kes Konnektörler, Yüksek Yoğunluklu Polietilen (Nalgene VWR Katalog No 62.868-021) Hızlı kes Connector adaptör ile ışık kaynağı için uygun kapalı sonundan itibaren 2 mL işaretine kesilmiş 15 ml Santrifüj Tüpü (VWR International), Tek kanallı odasına astar filtre kağıdı üzerine kinin çözüm yüklemek için 200 mcL pipetter T-Labirent (Basit Davranış Sistemleri; Şekil 1) Alüminyum Folyo Işık Kaynağı (Zeiss) Kırmızı ışık olan bir lamba. Filtre Kağıdı Mini Alarm Timer / Kronometre (VWR Uluslararası) 3. Sinekler hazırlanması Sinekler, 25 standart mısır unu-agar-pekmez-maya ortamda tutulur ° C, 12 saat ışık / karanlık döngüsü. Virgin sinekler eclosion gün karbondioksit anestezi altında izole edilmiştir. Yaşlanma çalışmalar için, sinekler vialde yirmi gruplar halinde tutulur ve her 3 günde bir, taze bir flakon transfer. Genetik kökenden kaynaklanan farkları en aza indirmek için, yaşlanma çalışmaları için aynı ebeveyn çapraz kardeş sinekler kullanmak önemlidir. Her ikisi için deneyleri, sinekler vialde on sinekler gruplar halinde cinsiyetli ve korunur. Cinsiyet farkı davranışı üzerinde önemli ve veri 6 yorumlamak ve üremek için zor olabilir bir çalışmada, dişi ve erkek sineklerin karıştırmak için tavsiye edilir. Negatif geotaxis testi için, sinekler vialde on gruba sıralanır ve anestezi sonrası bir saatlik test. Bu lokomotor faaliyetleri üzerinde etkisi olabilecek bir sinek anestezi tamamen kurtarmak için çok önemlidir. APS testi için, her grubun sinekler tahlil yapılmadan önce, altı saat boyunca filtre kağıdı nemlendirilmiş bir, boş polistiren şişe su ile yerleştirilir. Bu sinekler tahlil önce açlıktan ve caydırıcı bir tat daha duyarlı olacağını garanti eder. Tahlil yapılır hemen önce, on bir grup her sinek sonra kaçmayı önlemek için, gevşek kapatılmış boş bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirilir. 4. Negatif Geotaxis Testi Geotaxis genellikle aynı genotip veya tedavi (100-200 sinekler her genotip / tedavi için toplam) 7 on kişiden on ila yirmi gruplar için ölçülür. Her grup ayrı bir flakon CO 2 anestezi aparatı ve yerde on kadın ya da erkek sineklerin göre gruplar. Anestezi kurtarmak için sinekler için en az bir saat izin verin. Her grup için iki boş polistiren şişeleri dikey olarak birbirine bakacak şekilde bant katıldı bu tür tırmanma aparatı, hazırlayın. Şişeleri açıklıklar mükemmel bile tırmanma sinekler için bir yüzey sağlamak için birbirleri ile uyumlu olduğunu emin olmak için çok önemlidir. Alt flakon için, 8 cm alt yüzeyi üzerinde dikey bir mesafe ölçmek ve her flakon flakon tüm çevresinde bir daire çizerek işaretlemek. On sineklerin bir grup dikkatli bir şekilde herhangi bir sinek kaçmasını engelleyen düşük şişenin içine aktarın. Hemen alt flakon güvenli iletişime açıklıklar yakın üst şişe ve bant ile kaplayın. Sineklerin tahlil yapmadan önce 1 dakika için yeni bir ortam için iklime alıştırmak için izin verin. Yavaşça flakonun alt sinekler dokunun ve musluk 10 saniye sonra 8 cm işareti üzerine tırmanmaya sineklerin sayısı ölçmek. Her deneme arasında 1 dakikalık dinlenme süresi için izin veren bu testte, aynı grup on kez tekrarlayın. Olarak 8 cm aştı grup başına sineklerin numarasını kaydedin.toplam sinekler yüzdesi. 5. Caydırıcı Phototaxis Bastırılması Testi (APS Testi) Le Bourg ve Buecher (2002) 4 adapte caydırıcı stimuli (Bu durumda, kinin acı bir tat) ışık ilişkilendirmek için onları eğitmek için, bu testte pozitif phototactic davranış sinekler patlatır. Bir eğitim / Klima aşamasından sonra, vahşi tip sinekleri caydırıcı bir tat ile ışıklandırılmış alan doçent ve bunu önlemek mümkün olacaktır. Sinekler tehlikeye öğrenme kapasiteleri ile bu dernek yapmak için başarısız olacak. Ayrıca, APS testi de kısa süreli hafıza fonksiyonu ölçmek için kullanılan öğrenilen görev hatırlayarak kendi yeteneğini test etmek için aynı test sonrası 6 saat klima zaten eğitimli sinekler tabi 5 uçar. Kinin Çözüm hazırlanması 0.1M stok solüsyonu (50ml distile su 1.98g) yapmak için kinin hidroklorür distile su ile çözülür. Stok solüsyonu küçük alikotları -20 ° C'de bir yıl kadar muhafaza edilebilir Stok solüsyonu distile su ile seyreltilmesi ile 1 mcM bir çalışma çözeltisi hazırlayın. T-Labirent hazırlanması T-labirent tuzak kapı ve iki bağımsız odaları, bir "karanlık" odasına ve bir "ışıklı" odası (Şekil 1) ile orta sütun oluşur. Odası hazırlık: iki 15 mL plastik santrifüj tüplerine almak ve alttan 2 mL işaretine kesilmiş bir kılavuz ile sona kapalı gördüm. Her iki ucunda konnektör adaptörleri Fit ve parafilm ile bağlantı mühür. Tüp sonunda adaptör Gooseneck ışık kaynağı için giriş yuvası olarak hizmet vermektedir. Işık kaynağı ile bir tüp bağlayın ve bu tüp "ışıklı" odasına olacaktır. "Karanlık" odası olarak hizmet etmek için diğer tüp, alüminyum folyo ile sarın. Distile su veya hafif odasında kağıt ve filtre kinin çözüm ya 180uL ekleyin. Tuzak kapı ile orta kapalı (Şekil 1), orta sütun her iki tarafta ışıklı ve karanlık odaları vidalama T-labirent birleştirin. Işıklı odasına ışık kaynağı yerleştirin. Eğitim caydırıcı stimuli phototaxis bastırmak için uçar Sökün T-labirent karanlık odası ve bu odanın içine bir sinek transferi ve hemen geri labirent karanlık tüp vidalı. Oda ışıkları kapatın ve kırmızı lamba açmak. 30 saniye boyunca karanlık odasında sinek iklime alıştırmak ve yavaş yavaş ışıklı odasının aydınlatan ışık kaynağı açmak için izin verin. Yavaş yavaş iki odadan ayıran tuzak kapı açın. Anında 10 saniye içinde ışıklı odasına doğru yürür, olumlu phototactic olarak kabul edilir ve tahlil için eğitimli olmaya hazır. Phototaxis başarısızlık görsel sistem sorunları gösterir ve testte negatif phototaxis hariç gerekir ile uçar. Caydırıcı Phototaxis Bastırılması (APS) eğitimi için, karanlık odaya geri olumlu phototaxis gösterdi sinek dokunun tuzak kapağını kapatın ve ışığı kapatın. Acclimatizing 30 saniye bekleyin. Bu süre zarfında ışıklı odasına kinin çözümü ile filtre kağıdı koydu. Yavaş yavaş tuzak kapı açmak ve ışığı açın. Kinin kaplı ışıklı odasının içine sinek yürüyüş izin verin. Bir dakika sonra, karanlık odaya geri sinek dokunun ve bu 9 kez daha tekrarlayın. (Tipik olarak, vahşi tip 3 ila 5 eğitim denemeden sonra ışıklı odasının önlemek uçar.) Eğitim hemen sonra, beş test eden çalışmalar yapılacaktır. Her test çalışmasında, ışık ışıklı odasına yürümeye eğitimli sinek açıldığında 10 saniye sonra izin verir. Işıklı flakon yürüyerek yapılmaması "güçlendirme yoluyla öğrenilen görev" eşdeğer "Pass" olarak kaydedilecektir. Pass oranı beş çalışmalarda üzerinde kaydedilir ve Şekil 2 PC0 (0 saat yazılan klima) olarak aşağıda gösterilmiştir. Sinekler Kısa Süreli Bellek Fonksiyonu değerlendirilmesi Eğitim ve ilk PC0 kayıtları sonra, her sinek orijinal gıda şişenin içine geri yerleştirilir ve altı saat boyunca bir kenara tuttu. Altı saat eğitim, konu her anında, önce olduğu gibi aynı şekilde yine 5 çalışmalarda, ve kaç kez sinek (başarısız) ışıklı flakon önler (geçer) veya gider kaydı. Bu başarı oranı, kısa süreli hafıza bir göstergesi PC6 (6 saat klima), olarak kaydedilir. 6. Veri Yorumlama ve İstatistiksel Analiz Negatif Geotaxis Testi Bu testte elde edilen ham veriler, her grupta 10 saniye içinde 8 cm işareti geçiş sinek sayısını temsil eder. Yüzdesi bu dönüştürme ve 10 seans üzerinden her grup için ortalama başarı oranı hesaplamak. Veriler, ortalama standart hata (SEM) ile grup başına ortalama bir başarı oranı (genotip, tedavi vb.) Olarak grafiksel olarak temsil edilmektedir. Gruplar arasındaki farklarsonra istatistiksel olarak anlamlı veya Öğrenci T-testi ve ANOVA kullanarak tespit edilebilir. Caydırıcı Phototaxis Bastırılması Testi Bu testte elde edilen ham veriler, beş ardışık çalışmalarda her anında ışıklı odasının önler sayısını olarak temsil edilmektedir. Başarı oranı, toplam çalışmalarda üzerinde başarılı kaçınma çalışmaların yüzdesi olarak hesaplanır. 15 sineklerin grup başına en az bu şekilde ortalama başarı oranı hesaplayınız. Ortalama başarı oranı PC6 (6 saat klima, "bellek" göstergesi) ilgili SEM ile Veri grafiksel ortalama başarı oranı PC0 ("öğrenme" göstergesi Klima hemen sonra) olarak temsil edilmektedir. Öğrenme ve hafıza endeksleri, vahşi tip ve "genetik olarak manipüle-iyi huylu" grubu (GFP eksprese uçar gibi) uygun hem gruplar arasında karşılaştırıldı. 7. Temsilcisi Sonuçlar Bu video deneyde, merkezi sinir sistemi sinek eksprese insan Tau öğrenme ve hafıza ve motor açıkları değerlendiren ve bu sinekler eksprese GFP performanslarını karşılaştıran. Drosophila insan Tau Nöronal aşırı ekspresyonu, 8 beyin ciddi vakuolizasyon neden ve öğrenme ve hafıza fonksiyonları 9 önemli eksiklikler yol gösterilmiştir . Şekil 2A gösterildiği gibi, 10 gün yaşlı kadın ya da erkek, uçar eksprese insan Tau yaş olarak eşleştirilmiş GFP eksprese kıyasla önemli lokomotor açıkları uçar. Buna ek olarak, bu sinekler PC0 başarı oranı kontrol grubuna göre gösterildiği gibi, acı tadı ile ışık ilişkilendirmek için başarısız gibi bir düşüş PC6 başarı oranı (Şekil 2B) tarafından gösterildiği gibi bu ilişkiyi hatırlamak için başarısız. Bu deney, daha fazla insan nörodejeneratif koşulları eğitim ve insanlar ve memelilerde görülen bazı davranışsal fenotipleri yansıtan Drosophila modelleri için kullanılabilir doğrular . Şekil 1. Caydırıcı Phototaxis Bastırılması Testi T-Labirent Kurulum A. Sol (folyo ile kaplanmış) ve "karanlık" boru filtre kağıdı ile kaplı bir tuzak kapı ile ayrılmış "ışıklı" şahin tüp, bağlı ışık kaynağı ile APSA deney için genel bir deney düzeneği. B. eğitim ve test aşamasında, sinek karanlık bir odasında ışık ışıklı odasında açıldıktan sonra tuzak kapı açıldı. Şekil 2. Temsilcisi kullanarak negatif geotaxis ve APS deney sonuçları, bir pan-nöronal sürücüsü ile eksprese GFP veya Tau uçar . Negatif geotaxis tahlil, 10-günlük yaşında erkek (mavi sütun) veya kadın (kırmızı sütun) eksprese GFP Tau-eksprese uçar daha yüksek tırmanma faaliyet gösterdi uçar. B. 20-günlük yaşında kadın eksprese GFP (PC6) işlevleri Tau eksprese uçar daha iyi öğrenme (PC0) ve bellek gösterdi uçar.