1. Введение В этом видео мы продемонстрируем два поведенческих тестов использованием дрозофилы, чтобы продемонстрировать измерения движения и обучения и памяти функции, которые оказываются под угрозой в нейродегенеративных расстройств. Во-первых, мы покажем, как опорно-двигательного поведения может быть измерена с помощью отрицательного анализа geotaxis. Во-вторых, мы проведем оценку обучения и памяти, способности использованием положительно phototactic мух, которые обучаются ассоциировать света с неприятным горьким вкусом, а затем протестированы через 6 часов для оценки функций памяти. Наконец, мы будем обсуждать последствия и ограничения этих поведение анализов. 2. Оборудование и реактивы Fly работы Стерео область (Zeiss) Малые кисти для толкания мух Дрозофилы углекислого газа (CO 2), наркозный аппарат (Geneseesci, Inc) Отрицательные Пробирной Geotaxis 28,5 х 95 мм Полистирол флакон (Capitol флакон, Inc) Мини-Alarm Таймер / Секундомер (VWR International) Sharpie ручки Скотч Отвращение Фототаксис борьбе Пробирной Хинин гидрохлорид (Sigma Aldrich, CAS номер: 6119-47-7) Дистиллированная вода Цифровая измерительная шкала для точного разбавления по весу Быстрый Отсоедините разъемы, полиэтилен высокой плотности (Nalgene VWR Каталог номер 62868-021) 15 мл Центрифуга Тюбе (VWR International), разрезать на 2 мл знаком с закрытым концом, чтобы соответствовать с быстрой адаптер Разъем для Отключите источник света Одноканальный 200 мкл pipetter загрузить хинин раствор на фильтровальной бумаге подкладка камеры Т-Maze (простой поведенческой системы; Рисунок 1) Алюминиевая фольга Источник света (Zeiss) Лампу с красным светом. Фильтровальная бумага Мини-Alarm Таймер / Секундомер (VWR International) 3. Подготовка мух Мухи ведутся на стандартных фуражное зерно-агар-патоки-дрожжевой среде при 25 ° С на 12 ч свет / темно-цикла. Девы мухи изолированы под наркозом углекислого газа в день eclosion. Для старения, мух ведутся в группах по двадцать на флакон и переданы в свежем флакон каждые 3 дня. Важно использовать родной брат летает из той же родительской кресте за старения, чтобы свести к минимуму различия, связанные с генетическими фонов. Для обоих тестов, мухи сексуальны и поддерживается группами по десять мух на флакон. Гендерных различий на поведение является значительным и желательно не смешивать мужские и женские мухи в исследовании как данные могут быть трудно интерпретировать и воспроизводить 6. При отрицательном анализе geotaxis, мух разбиты на группы по десять на флакон и испытаны в течение часа после наркоза. Важно, чтобы мухи восстановить полностью из наркоза, поскольку это может оказать влияние на опорно-двигательной деятельности. Для анализа APS, мух каждой группы помещаются в пустой флакон полистирола с водой смоченной фильтровальной бумаги в течение шести часов до анализа не производится. Это гарантирует, что мухи от голода до анализа и будет наиболее восприимчив к неприятным вкусом. Перед анализ проводится, каждый летать из группы десяти помещается в пустую 15 мл центрифужную пробирку, которую затем ограничен свободно, чтобы не убежать. 4. Отрицательные Пробирной Geotaxis Geotaxis обычно измеряется в течение десяти до двадцати групп из десяти особей того же генотипа или лечения (100-200 мух итог для каждого генотипа / лечение) 7. Сортировать группы из десяти женщин или мужчин летает на CO 2 аппарата анестезии и место каждой группы в отдельную пробирку. Позвольте по крайней мере, один час для мух, чтобы оправиться от наркоза. Подготовка восхождения аппарата для каждой группы, так, что два пустых флаконов полистирола вертикально соединены лентой лицом друг к другу. Важно, чтобы убедиться, что отверстия флаконы идеально ровные друг с другом, чтобы обеспечить даже восхождение поверхность для мух. Для нижней флакон, измерять расстояние по вертикали от 8 см выше поверхности дна и пометить каждый флакон, нарисовав окружность вокруг всей окружности флаконе. Передача группу из десяти летит в нижний флакона тщательно предотвращения побега любой летать. Немедленно закрыть нижнюю флакон с верхней флакон и ленты надежно возле связавшись отверстия. Разрешить мух для адаптации к новой настройки в течение 1 минуты до проведения анализа. Аккуратно нажмите летит вниз на дно флакона и измерить количество мух, которые могут подняться выше 8-см знака через 10 секунд после крана. Повторите этот тест для той же группы в десять раз, что позволяет в течение 1 минуты период отдыха между каждой попытке. Запись количества мух в группе, которая прошла 8-см пометить какПроцент от общего числа мух. 5. Отвращение Фототаксис борьбе анализ (APS Пробирной) Изначально взято из Ле Бур и Бюхер (2002) 4, этот анализ подвиги положительное поведение phototactic у мух, чтобы обучить их, чтобы связать свет с стимулы отвращение (в данном случае, горький вкус хинина). После обучения / кондиционирования фазы, диких мух типа смогут ассоциировать освещенной зоне со вкусом отвращение и избегать его. Мухи с ослабленной возможности обучения будет не в состоянии сделать этого объединения. Кроме того, анализ APS может также использоваться для измерения краткосрочных функцией памяти мух 5, подвергая уже подготовленных летит в тот же тест 6 часов после кондиционирования проверить свои способности в запоминании узнал задачи. Подготовка Хинин решения Растворите хинина гидрохлорида в дистиллированной воде, чтобы сделать 0,1 М раствора акций (1.98g в 50 мл дистиллированной воды). Маточный раствор можно хранить при температуре -20 ° С до года в небольших аликвот Подготовка рабочего раствора 1 мкМ путем разбавления исходного раствора в дистиллированной воде. Подготовка Т-Maze Т-лабиринт состоит из центральной колонки с люк и два независимых камер, "темный" камеры и "засветившихся" камеры (рис. 1). Палата приготовления: взять две 15 мл пластиковые пробирки центрифуги и сократить в 2 мл знаком со дна закрытым концом с ручной пилой. Установите разъем адаптера на каждом конце, и печатью связи с парафильмом. Адаптер на конце трубки служит входной разъем для источника света гусиная шея. Подключите один трубку с источником света и эта трубка будет "засветившихся" камеры. Оберните другую трубу с алюминиевой фольгой, чтобы служить в качестве «темной» камеры. Добавить 180uL либо дистиллированную воду или хинин решение фильтровальную бумагу и поместите в свет камеры. Соберите Т-образном лабиринте при помощи винтов освещенных и темных камерах с каждой стороны от центральной колонки, с люком в середине закрытых (рис. 1). Вставьте источник света на освещенную камеру. Обучение мухи, чтобы подавить фототаксис с отвращение стимулы Отвинтите темной камере от Т-образном лабиринте и передачи одного летать в эту камеру и сразу же винт темно трубку обратно в лабиринт. Выключите свет в комнате и включить красный фонарь. Разрешить летать, чтобы акклиматизироваться в темной камере в течение 30 секунд и медленно включите источник света освещает освещенной камере. Медленно откройте люк, который отделяет две камеры. Если лететь идет к освещенной камере в течение 10 секунд, он считается положительно phototactic и готов быть обучены для анализа. Неудача в фототаксис указывает на проблемы в зрительной системе и летит с отрицательным фототаксис должны быть исключены из анализа. Для отвращение Фототаксис борьбе (APS), обучение, нажмите летать, которые продемонстрировали положительный фототаксис обратно в темную комнату, закройте люк и выключить свет. Разрешить 30 секунд акклиматизации. За это время положить фильтровальную бумагу с хинином раствора в освещенную камеру. Медленно откройте люк и включите свет. Разрешить летать ходить в хинин покрытием освещенной камере. Через одну минуту, нажмите лететь обратно в темную камеру и повторите это еще 9 раз. (Как правило, дикого типа мухи избежать освещенной камере после 3-х до 5 испытаний обучения.) Сразу же после тренировки, пять испытаний тест будет проводиться. В каждом тесте суда, позволит через 10 секунд после свет включается на обучение летать ходить на освещенную камеру. Отказ идти к освещенному флакон будет записан как "Pass", которое эквивалентно "Задача, извлеченные в ходе подкрепление". Проходной балл в течение пяти последовательных испытаний записывается и показано на рисунке 2, как PC0 (0 ч после кондиционирования). Оценка кратковременной памяти Функция в Мухи После обучения и начальной PC0 записей, каждая муха помещены обратно в исходное флакон пищи и держали в стороне в течение шести часов. Шесть часов после подготовки, с учетом каждого лететь в 5 испытаниях снова таким же образом, как и прежде, и записывать, сколько раз летать избегает (пропуск) или переходит в (провал) освещенные флаконе. Это проходной балл, отражается в качестве PC6 (6 часов после кондиционирования), который является показателем кратковременной памяти. 6. Интерпретация данных и статистический анализ Отрицательные Пробирной Geotaxis Сырые данные, полученные из этого анализа представляет собой количество мух пересечении 8-см отметку в 10 секунд в каждой группе. Преобразование это процент и вычислить среднюю скорость передачи для каждой группы в течение 10 сессий. Данные представлены графически в виде среднем пропуск на группу (генотип, лечение и т.д.) с стандартная ошибка среднего (SEM). Различия между группамиможет быть определена как статистически значимые или не использования студенческих Т-тест или ANOVA. Отвращение Фототаксис борьбе Пробирной Необработанные данные из этого анализа представляется как число выступлений каждого летать избегает освещенных камеры в пяти последовательных испытаний. Пройти курс рассчитывается как процент успешных испытаниях избежание более общего исследования. Рассчитать среднюю скорость передачи таким образом, в течение минимум 15 мух на группы. Данные графически представлены как средняя скорость передачи PC0 (сразу после кондиционирования; "обучения" индикатор) или средней скорости передачи PC6 (6 часов после кондиционирования; «память» индикатор) с соответствующими SEM. Обучение и память индексы сравниваются между группами и с диким типом и "генетически манипулировали-доброкачественная" группу (например, GFP гиперэкспрессией мух) соответственно. 7. Представитель Результаты В этом видео-эксперимент, мы оцениваем обучения и памяти и моторных дефицитов у мух гиперэкспрессией человека Тау в центральной нервной системе и сравнение их эффективности с тех мух гиперэкспрессией GFP. Нейронные гиперэкспрессия человека Тау у дрозофилы было показано, что причиной тяжелых вакуолизация в головном мозге 8 и привести к значительному дефициту в процессе обучения и памяти функции 9. Как показано на рисунке 2А, 10 день старого мужчины или женщины мухи гиперэкспрессией человека Тау имеют значительный дефицит двигательной по сравнению с подобранных по возрасту GFP гиперэкспрессией мух. Кроме того, эти мухи не удалось связать свет с горьким вкусом, как показано на PC0 проходной балл по сравнению с контрольной группой, а также не вспомнить эту ассоциацию как показали снижение PC6 проходной балл (рис. 2В). Этот эксперимент подтверждает, что дальнейшее дрозофилы модели могут быть использованы для изучения человеческих нейродегенеративных заболеваний и сводный некоторые поведенческие фенотипы наблюдается у человека и млекопитающих. Рисунок 1. Т-Maze установки для отвращение Пробирной борьбе Фототаксис. A. Общей экспериментальной установки для эксперимента APSA с источником света связано с "засветившихся" Сокол трубки с подкладкой из фильтровальной бумаги и "темная" труба слева (покрыта фольгой), разделенных люк. Б. Во время фазы обучения и тестирования, муха в темной камере и люк открыт после свет включен в освещенную камеру. Рисунок 2. Представитель результаты отрицательные geotaxis и APS эксперимент с использованием мухи гиперэкспрессией GFP или Тау с пан-нейронов водителя. A. В отрицательном анализе geotaxis, 10-дневный летний мужчина (синий столбец) или женский (красный столбец) мухи гиперэкспрессией GFP показали более высокие восхождение активность, чем Тау с гиперэкспрессией мух. B. 20-дневных самок гиперэкспрессией GFP показал лучшее обучение (PC0) и памяти (PC6) функций, чем Тау гиперэкспрессией мух.